爬虫類、同種他個体から皮膚脂質は性的信号、外来種の管理で潜在的な使用のために重要であります。ここでは、小屋の皮または全体の動物から皮膚脂質の抽出のためのプロトコルについて述べる決定、総脂質量の分析とカラムクロマトグラフィーで分画を用いた脂質を分離します。
爬虫類仲間の追跡と評価を有効にするのには主に彼らの皮膚の脂質を用いた個体へ信号を送る。これらの脂質の分離では、地球生命の進化における脂質の防水の役割を理解することに加えて、化学コミュニケーションの進化のパターンとメカニズムに焦点を当てた研究ではユーティリティがあります。応用アプローチでこのような皮膚ベース手がかり野生生物の管理外来種への対処のための潜在的な使用があります。抽出、総脂質定量こと化合物精製溶出物の結果後者のプロセスを介してカラム ・ クロマトグラフィの分別などがここで提示されたプロトコルで爬虫類の肌脂質を定量化するための主な手順どちらかは化合物同定 (例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析法 [GC-MS]) を割り当てるために分析やより洗練された生物検定で直接使用可能です。皮膚の脂質は生活の皮膚から抽出することができます、無極性の有機溶剤 (例えばヘキサン、ベンゼン、トルエン) を使用して、皮膚、または死んで全体の動物を当てます。抽出の可溶性脂質、収量測定可能な脂質だけ抽出する溶媒を蒸発することができます。分別には、特定の波を介して伝統的なカラム ・ クロマトグラフィに総脂質抽出物の分離が含まれます。総脂質抽出物はまず基板ベースの列 (例えばアルミナ) 行き、個々 溶出物 (「分数」) 特定のボリュームで溶剤がの溶出が化合物脂質の混合物からのセットの列を順番に渡されます、一般的な極性に基づいています。非極性溶媒の極性溶媒 (例えば、ジエチル エーテル) の相対量を増やすことによって標準化されたシーケンスで極性の分数の進行状況。本稿では、爬虫類の肌脂質を抽出のいくつかの方法について説明し、従来のカラム ・ クロマトグラフィを使用して極性化合物の異なるセットを分離するための標準プロトコルを提供します。全脂質を抽出またはそこに化合物によって誘発される任意の生物学的活性を決定する、特定の分数の生物検定で使用できます。
爬虫類は、表皮の皮膚細胞から直接、またはチームメイト評価と追跡、縄張り意識と内および種間の認識1,2 など、社会的なコミュニケーションで使用される個別の腺からの脂質を生成します。 ,3,4。これらの皮膚の脂質の分離に地球生命2,3 の進化における脂質の防水の役割を理解することに加えて、化学コミュニケーションの進化のパターンとメカニズムに焦点を当てた研究のユーティリティは、します。 ,4。さらに、多くの爬虫類、敏感な生態系に懸念の外来種であり、トラップと除去を向上させるフェロモン系ルアーの開発、継続的な5,6squamates (トカゲ, ヘビ)、特に。爬虫類皮の不浸透性脂質の化学的な信号の可能性がある強力な源の比較的純粋な抽出を取得するための抽出が容易になります。説明プロトコルで爬虫類の皮膚の脂質を定量化するための原則手順には、抽出、総脂質定量および列クロマトグラフィーによる分画1,6,7が含まれます。配偶者選択と選択、特にヘビ2についてはあまり説明生理活性物質の分離ようにメソッドを定期的に使用されています。
生きている肌、小屋の皮、または死んで全体爬虫類、非極性を使用してまたは極性有機溶媒1,7,8,9から皮膚脂質を抽出できます。それは、博物館の標本内のエタノールなどの溶剤が皮膚脂質の抽出のために最適ではない、唯一の新鮮なまたは冷凍新鮮な死体は、抽出のための可能な源として見なす必要があります注意してください。皮膚脂質いる不活性であり、安定した皮膚の表面と7を抽出しやすい。爬虫類生態学におけるシグナル伝達の役割で皮膚脂質手がかりがしばしば堆積する過酷な環境で、その堅牢な化学特性のためこのような手がかりは時間10,11の長期間にわたってその情報の価値を保持することが,12. 抽出プロセスは、-長い時間浸漬、脂質抽出7の測定可能な質量を残して、溶媒の蒸発が続く上 (例えばヘキサン、ベンゼン、トルエン) 無極性溶媒を用いた脂質を可溶性,8. 皮膚脂質が高い非極性溶媒に混和性と同様に多様なソースから幅広い炭化水素を抽出できます。
分別抽出よりもですが、特定の分数でカラム ・ クロマトグラフィ、化合物の精製と同定そこに1,を支援するために総脂質抽出を区切るために6,7,8. 総脂質抽出物、基板ベースの列にバインドされ、個々 溶出物 (「分数」) 特定のボリュームで溶剤共通がある脂質の混合物からの化合物セットを溶出する列順番に渡される極性6,7,8。脂質クロマトグラフィーにおけるいくつかの極性の分数進歩は無極性溶媒中の極性溶媒 (例えば、ジエチル エーテル) の相対量を増やすことでシーケンスを標準化 (通常パーセントとして表現される: 0%、2%、4% エーテル、など。)6,7,8。個別より混合物を集中すると互換性のあるメソッドは、薄層クロマトグラフィー (TLC) は、単純な混合物で脂質を分離する使用ことができますよう、カラム ・ クロマトグラフィはクローズド システムを使用するための優先は、制御することができます簡単です。効率化のため多重化。本稿では、爬虫類の肌脂質を抽出のいくつかの方法について説明し、従来のカラム ・ クロマトグラフィを使用して極性化合物の異なるセットを分離するための標準プロトコルを提供します。化学手掛かりの分離を含む多くの研究プロジェクトの究極の目標にこれらの手がかりにさらされる受信機に影響する変更です。全脂質を抽出または任意の生物学的活性を誘発化合物によってそこに1,2,6,7を決定する、特定の分数の生物検定で使用できます。たとえば、基礎生物学的研究で、フェロモンの精製されたソースが分離されているし、ターゲット化合物の同定方法を追求できる研究者に特定の分数を用いた生物検定が明らかに。野生動物管理の観点から識別の目的、ないかもしれないし、トラップに同種の誘致または外来生息地13,14の追跡の仲間を阻害するフィールドでの活性画分を使用できる代わりに。
爬虫類の皮膚脂質の抽出は、小屋の皮、このテクニックの実験用途の多様性を提供するだけでなく、生活や死者の皮膚に適用できます。さらに、幅広い生物学者2,13にメソッドの動的なアプリケーションを有効にする、フィールドで皮膚脂質の抽出を行うことができます。皮膚脂質の抽出は簡単です。したがって、抽出実験や設計のあたり、必要に応じて拡張する簡単だし、メソッドの実行に重要な専門知識が必要な実務家。スケール アップのための唯一の制限要因は、ヒューム フードの空席状況、きれいな、密閉式のガラス製品、溶剤ストレージ ・ スペースの豊富さです。
皮膚脂質抽出分画は研究者のニーズに合わせてすることができますそして、したがって、脂質の抽出する同じような柔軟性があります。たとえば、中性脂質を溶出し、関心の化合物の浄化、生物検定を簡素化したターゲット分数のため、破棄できます。分別は、複数の縮尺内および脂質のサンプル間で実行できます。たとえば、プロセスをより効率的に複数の列を同時に実行できます。または、総脂質抽出物の部分だけはしたがって、試薬および時間を倹約する小さい列に分別できます。分別は主に総脂質抽出物の質量と研究者に利用できる機器の精度によって制限されます。たとえば、質量、したがって研究者に 10.0 mg 精度、端数の決定とバランスがある場合ガスクロマトグラフィー質量分析のための試料の前処理の精度は大幅にいない場合は、完全に阻害します。ガラスの場合も同じです。研究者分別の大ボリューム列が分離する小さな総脂質質量場合、溶出したり、化合物の分離が進行するが、溶剤、試薬、時刻、および可能性のある、ターゲットの重要な消耗が必要になります自分自身を化合物します。
表 2で見られるように溶出スキームを決定する前に品質管理チェックを実行し、どのような分数を破棄可能性がありますを決定するをお勧めします。列必要な脂質の溶出を確認するには、ことができます実行各分画、1-15 が個別に収集され、分析され、使用する GC MS。図 3に代表的なガスクロマト トレースを見るとガーターヘビからメチル ケトンが特定の割合の列からのみ溶出します。この品質管理手順を実行すると、興味の化合物の最大収量を確保するため特定の種の変更された溶出スキームを開発できます。サプライヤーやアルミナのロットまたはジエチル エーテルの年齢など、材料の変更は品質管理テストの実行によっての制御されるべき溶出の違いで絶対になります。
説明した手法は、主に得ることができるキューの化学的性質によって制限されます。主に、これらのメソッドは、分離し、爬虫類の皮膚から長鎖脂質を分離する研究者をのみ許可します。爬虫類の多くの種、化学的な信号として空中やタンパク質の手がかりを使用して記述されているメソッドは当該合図を分離すると互換性がないです。さらに、無極性の溶媒が爬虫類の表面や豊富な化学信号を含めることができます確かにキュー沈着量 (例えばケージ水、糞便、水生基板) のソースから水性の手がかりを抽出できません。手がかりのこれらのタイプを取得するための適切な方法が (例えば固相固相マイクロ抽出 [SPME] 揮発性キューとキューの水性高性能液体クロマトグラフィー [高速液体クロマトグラフィー]) の研究者に利用できる方法のように上記で説明した、技術的な学習曲線があります。
最も重要なは、研究者に最終的な化学混合物の有用性は、使用方法を導くべきであります。例えば、研究者は、男性焦点動物男性対女性異性対象生物検定によって生成されるキューを区別できるかどうかを知りたいと、抽出は唯一の方法は、2、3を必要なです。ただし、抽出は特定の分子または分子による化学分析の1、グループ識別子を割り当てることで大きな自信を有効に浄化されるすべき場合、目的である性的に二形の化合物の同定 6,9,11。ただし、脂質ソース クロマトグラフィーを行うも、抽出を開始の重要な質量が必要、測定可能な割合の固まりを得ることができる;それ以外の場合、サンプルのプーリング追求できる、最適な14ではありません。
このプロトコルの将来の発展には活用しより爬虫類種の手順を適応するための措置が含まれます。皮膚の脂質を抽出追加非侵襲的方法も開発されています。
The authors have nothing to disclose.
これらのメソッド、特に小屋皮膚脂質抽出の開発は、ジェームズ ・ マディソン大学 (作る) と米国農務省の動物の間の協力協定 (14-7412-1061-CA、15-7412-1155-CA、および 16-7412-1269-CA) 中に発生しましたおよび植物の健康点検サービス (APHIS)。M.R.P. 小屋肌メソッドの開発に次の学生の貢献を認め: s. パテル (ワシントン ・ アンド ・ リー大学 [WLU])、j. Zachry (WLU)、r. フローレス (作る)、j. ノル (作る)、s. アシュトン (作る)。
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |