Bei Reptilien sind Hautlipiden von Artgenossen zum sexuellen signalisieren, mit möglichen Einsatz in invasive Arten Management entscheidend. Hier beschreiben wir Protokolle für die Gewinnung von Hautlipiden aus Schuppen Haut oder ganze Tiere, Bestimmung und Analyse der gesamten Lipid-Mass und trennt die Lipide mit Fraktionierung über Säulenchromatographie.
Reptilien-signal zu Artgenossen mit Lipiden in ihrer Haut in erster Linie um Mate, die Verfolgung und Beurteilung zu ermöglichen. Die Isolation der diese Lipide hat Dienstprogramm in der Forschung konzentriert sich auf evolutionären Muster und Mechanismen der chemischen Kommunikation neben Abdichtung Rollenverständnis von Lipiden in der Evolution des irdischen Lebens. In angewandter Ansatz haben solche Haut basierenden Cues Einsatzmöglichkeiten für Wildtier-Manager Umgang mit invasiven Arten. Die wichtigsten Schritte zur Quantifizierung der Reptilien Hautlipiden im hier vorgestellten Protokoll gehören Extraktion, insgesamt Lipid Entschlossenheit und Fraktionierung über Säulenchromatographie, das letztere Verfahren gereinigten Eluate von Verbindungen, die dann wiederum entweder werden analysiert, um zusammengesetzte Identifikationen (z. B.Gaschromatographie-Massenspektrometrie [GC-MS]) zuweisen oder direkt in feiner Bioassays verwendet. Hautlipiden extrahiert werden können, von der lebenden Haut, Haut, oder tot ganze Tiere, mit unpolaren organischen Lösungsmitteln (z.B.Hexan, Benzol, Toluol) vergossen. Extraktion solubilisiert Lipide und dann das Lösungsmittel verdunstet werden kann, um eine messbare nur-Lipid-Extrakt ergeben. Fraktionierung bedeutet die Trennung von den insgesamt Lipid-Extrakt in bestimmten Eluate über traditionellen Säulenchromatographie. Der gesamten Lipid-Extrakt ist zunächst auf ein Substrat-basierten Spalte (z.B. Aluminiumoxid) gebunden und dann individuelle Eluate (“Fraktionen”) des Lösungsmittels an bestimmte Volumes sind durchlaufen nacheinander die Spalte Sätze von Verbindungen aus der Lipid-Mischung eluieren basierend auf gemeinsamen Polarität. Die Fraktionen Fortschritte in der Polarität auf eine standardisierte Abfolge durch Erhöhung der relativen Menge des polaren Lösungsmittels (z.B. Diethylether) in unpolaren Lösungsmittel. In dieser Handschrift die, wir beschreiben mehrere Methoden zur Extraktion von Hautlipiden Reptilien und dann ein Standardprotokoll für unterschiedliche Verbindungen basierend auf Polarität, isolieren mit traditionellen Säulenchromatographie. Ganze Lipid-Extrakte oder bestimmte Fraktionen können dann in Bioassays biologischen Aktivität ausgelöst durch die Verbindungen darin bestimmen verwendet werden.
Reptilien produzieren Lipide in der Epidermis, entweder direkt aus Hautzellen oder aus diskreten Drüsen, die in sozialer Kommunikation, wie z. B. Mate Bewertung und Nachverfolgung, Territorialität, und intra- und interspezifische Anerkennung1,2 verwendet werden ,3,4. Die Isolation der diese Hautlipiden hat Dienstprogramm in der Forschung konzentriert sich auf evolutionären Muster und Mechanismen der chemischen Kommunikation neben Abdichtung Rollenverständnis von Lipiden in der Evolution des irdischen Lebens2,3 ,4. Darüber hinaus viele Reptilien, vor allem Squamates (Eidechsen, Schlangen), sind invasive Arten von Bedeutung in empfindliche Ökosysteme und die Entwicklung von Pheromon-basierte lockt zur Verbesserung der Fangmethoden und Entfernung ist laufenden5,6. Die Dichtheit von Reptilienhaut ermöglicht die Extraktion der Lipide vorhanden, relativ reine Extraktionen einer potenziell robuste Quelle der chemischen Signale zu erhalten. Das Prinzip Schritte zur Quantifizierung der Reptilien Hautlipiden im beschriebenen Protokoll gehören Extraktion, insgesamt Lipid Entschlossenheit und Fraktionierung über Spalte Chromatographie1,6,7. Die Methoden wurden routinemäßig verwendet, da sie erzielen bioaktive Isolate, die viel über Partnerwahl und Auswahl, vor allem in Schlangen2erklären.
Hautlipiden können lebende Haut, Schuppen-Haut, oder tot ganze Reptilien, mit unpolaren oder polaren organischen Lösungsmitteln1,7,8,9entnommen werden. Es sei darauf hingewiesen, dass Museumsexemplaren gespeichert in Lösungsmitteln wie Ethanol nicht optimal für die Gewinnung von Hautlipiden sind und nur frischen oder frisch gefrorenen Kadaver mögliche Quellen für die Extraktion als sollten. Hautlipiden sind träge, wodurch sie stabil an der Oberfläche der Haut und leicht zu7zu extrahieren. In ihre Signalisierung Rollen in Reptil-Ökologie Haut-Lipid-Cues sind oft in rauen Umgebungen hinterlegt, sondern wegen ihrer robusten chemischen Eigenschaften können solche Hinweise behalten ihren Informationswert über längere Zeit10,11 , 12. der Extraktionsprozess solubilisiert die Lipide mit einem unpolaren Lösungsmittel (z.B.Hexan, Benzol, Toluol) über eine Stunden lang einweichen, gefolgt von der Verdampfung des Lösungsmittels, lassen Sie eine messbare Masse von Lipid-Extrakt7 , 8. Hautlipiden sind hoch in unpolaren Lösungsmitteln mischbar, und eine Vielzahl von Kohlenwasserstoffen aus ebenso vielfältige Quellen extrahiert werden kann.
Fraktionierung ist mühsamer als Extraktion sondern dient dazu, die gesamten Lipid-Extrakt in bestimmten Fraktionen über Säulenchromatographie, Hilfe bei der Reinigung und mögliche Identifizierung der Verbindungen darin1, trennen 6 , 7 , 8. der gesamten Lipid-Extrakt wird gesprungen, um ein Substrat-basierten Spalte und dann einzelne Eluate (“Fraktionen”) des Lösungsmittels an bestimmte Volumes sind durchlaufen nacheinander zu eluieren Sätze von Verbindungen aus der Lipid-Mischung, die eine gemeinsame Spalte Polarität6,7,8. Lipid-Chromatographie, standardisiert die Fraktionen Fortschritte in der Polarität an einigen Sequenz durch Erhöhung der relativen Menge des polaren Lösungsmittels (z.B. Diethylether) in unpolaren Lösungsmittel (in der Regel als Prozentwert ausgedrückt: 0 %, 2 %, 4 % Äther, etc.. )6,7,8. Obwohl Methoden wie Dünnschichtchromatographie (TLC) verwendet werden, kann um Lipide sind einfacher und Gemisch zu trennen, Säulenchromatographie bevorzugt, weil es ein geschlossenes System, nutzt leicht ist zu steuern, können separate mehr konzentrierte Mischungen, und ist kompatibel mit Multiplexing für Effizienz. In dieser Handschrift die, wir beschreiben mehrere Methoden zur Extraktion von Hautlipiden Reptilien und dann ein Standardprotokoll für unterschiedliche Verbindungen basierend auf Polarität, isolieren mit traditionellen Säulenchromatographie. In vielen Forschungsprojekten, an denen die Isolierung der chemischen Signale ist das ultimative Ziel um Veränderung in den Empfängern diese Cues ausgesetzt. Ganze Lipid-Extrakte oder bestimmte Fraktionen können dann in Bioassays verwendet werden, um festzustellen, dass biologischer Aktivität durch die Verbindungen darin1,2,6,7ausgelöst. In der biologischen Grundlagenforschung können beispielsweise Bioassays mit bestimmten Fraktionen Forscher offenbaren, dass eine gereinigte Quelle von Pheromonen isoliert wurde und dann Methoden zur Identifizierung der Ziel Verbindungen verfolgt werden können. Aus Sicht der Wildlife-Management Identifikation kann nicht das Ziel sein, und stattdessen könnten der aktiven Anteil im Feld zu Artgenossen in fallen locken oder hemmen Mate-tracking in ausländische Lebensraum13,14verwendet werden.
Die Gewinnung von Hautlipiden bei Reptilien einsetzbar, lebende oder tote Haut, neben Schuppen-Haut, die Vielseitigkeit in der experimentellen Anwendung dieser Technik bietet. Darüber hinaus können Extraktionen von Hautlipiden im Feld ermöglichen eine dynamische Anwendung der Methode zu einer Vielzahl von Biologen2,13erfolgen. Gewinnung von Hautlipiden ist einfach; Daher, es ist leicht, scale-up Extraktionen Bedarf pro Experiment oder Design und Praktiker müssen nicht signifikante Erfahrung die Methoden ausführen. Die einzige limitierenden Faktoren für die Aufstockung sind die Verfügbarkeit von Dunstabzugshaube Platz, eine Fülle von sauberen, verschließbaren Glas und Lösungsmittel Stauraum.
Haut-Lipid-Extrakt-Fraktionierung kann auf ein Forscher Bedürfnisse zugeschnitten werden und daher hat ähnliche Flexibilität, Lipid-Extraktion. Beispielsweise können neutrale Lipide eluiert und dann verworfen, um Ziel Brüche führen, die eventuell Verbindungen des Interesses zu reinigen, Bioassays zu vereinfachen. Fraktionierung kann auf mehreren Skalen innerhalb und zwischen den Lipid-Proben durchgeführt werden. Beispielsweise können mehrere Spalten gleichzeitig ausgeführt werden, um den Prozess effizienter zu gestalten. Oder nur ein Teil des gesamten Lipid-Extrakt kann fraktioniert auf eine kleine Spalte zu, damit, Reagenzien und Zeit ersparen. Fraktionierung ist in erster Linie durch die Masse der gesamten Lipid-Extrakt und die Genauigkeit der Geräte zur Verfügung, um die Forscherin begrenzt. Zum Beispiel bei der Forscher eine Bilanz mit einer 10,0 mg-Präzision, die Bestimmung des Bruches Masse und somit ist die Genauigkeit der Probenvorbereitung für die GC-MS-Analyse deutlich, wenn auch nicht vollständig, behindert. Das gleiche gilt für die Glaswaren. Wenn der Forscher eine großvolumige Spalte für die Fraktionierung hat, aber eine kleine Summe Lipid-Masse hat zu trennen, die Elution oder Trennung der Verbindungen wird Fortschritt aber erfordert eine erhebliche Verschwendung von Lösemitteln, Reagenzien, Zeit und möglicherweise das Ziel Verbindungen selbst.
Es wird empfohlen, eine Qualitätskontrolle vor der Bestimmung der Elution Schema durchführen, wie in Tabelle 2dargestellt, und entscheiden, welche Fraktionen verworfen werden können. Die Elution der gewünschten Lipide, eine Spalte zu bestätigen kann Lauf wo jede Fraktion, 1-15, einzeln gesammelt und anschließend analysiert, GC-MS verwenden. In Abbildung 3zeigen repräsentative Gaschromatograph Spuren, dass Methyl-Ketone von Strumpfbandnattern nur aus der Spalte in einem bestimmten Bruchteil eluieren. Von diesem Schritt Qualitätskontrolle, kann eine modifizierte Elution Schema für eine gegebene Art um die maximale Ausbeute an die Verbindungen des Interesses zu gewährleisten entwickelt werden. Änderungen in den Materialien, wie z. B. Lieferant oder Menge von Aluminiumoxid oder das Alter der Diethylether werden absolut unterschiedlichen Elution führen, die für kontrolliert werden sollte, durch eine Qualitätskontrolle Test.
Die beschriebenen Techniken sind vor allem durch die chemische Natur der Cues beschränkt, die erreicht werden kann. Diese Methoden ermöglichen in erster Linie nur Forscher isolieren und langkettige Fette aus der Haut der Reptilien zu trennen. Viele Arten von Reptilien in der Luft und/oder proteinhaltige Cues als chemische Signale verwenden, und die beschriebenen Methoden sind nicht kompatibel mit genannten Hinweise zu isolieren. Weitere, unpolaren Lösungsmitteln extrahiert nicht wässrigen Hinweise von den Oberflächen der Reptilien oder Quellen der Cue-Ablagerung (z.B., Käfig Wasser, Fäkalien, aquatische Substrat), die in der Tat reichlich chemische Signale enthalten können. Geeignete Methoden für die Erfassung derartiger Hinweise stehen Forscher (z.B.Solid Phase Microextraction [SPME] für flüchtige Cues und Hochleistungs-Flüssigchromatographie [HPLC] für wässrige Hinweise), obwohl, wie die Methoden oben beschrieben, gibt es eine technische Lernkurve.
Am wichtigsten ist, sollte das Dienstprogramm der endgültige chemische Mischung, die Forscher verwendeten Methoden leiten. Beispielsweise wenn ein Forscher will wissen, ob die Signale, die durch männliche vs. weibliche Artgenossen in eine gezielte Bioassay produziert ein männliches fokale Tier unterscheiden kann, ist die Extraktion, brauchte die einzige Methode,2,3. Wenn die Identifizierung von sexuell dimorphen Verbindungen das Ziel ist, darf jedoch der Extrakt gereinigt werden, um mehr Vertrauen in bestimmte Moleküle oder Gruppen von Molekülen über chemische Analyse1Kennungen zuweisen zu können, 6,9,11. Um die Chromatographie mit einer Lipidquelle selbst durchführen zu können, ist eine bedeutende Masse des Beginnens Extrakt jedoch erforderlich damit messbare Massenanteile erzielt werden können; Andernfalls die Bündelung von Proben kann verfolgt werden jedoch nicht optimale14.
Zukünftige Entwicklungen dieses Protokolls gehören Maßnahmen zu nutzen und das Verfahren für mehr Reptilien Arten passen. Weitere nicht-invasive Methoden der Gewinnung von Hautlipiden werden auch entwickelt.
The authors have nothing to disclose.
Die Entwicklung dieser Methoden, insbesondere Schuppen Haut Lipid Extraktion, Kooperationen (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA und 16-7412-1269-CA) zwischen James Madison University (JMU) und das US Department of Agriculture Animal aufgetreten und Plant Health Inspection Service (APHIS). M.R.P. anerkennt die Beiträge der folgenden Studenten zur Entwicklung der Schuppen-Haut-Methoden: S. Patel (Washington and Lee University [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) und S. Ashton (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |