在爬行动物中, 来自中性的皮肤脂质对于性信号至关重要, 有可能用于入侵物种管理。在这里, 我们描述了从脱落的皮肤或整个动物中提取皮肤脂质, 确定和分析总脂质, 并通过柱层析分离脂质的方案。
爬行动物使用皮肤中的脂质向配偶发出信号, 主要是为了实现配偶的跟踪和评估。除了了解脂质在陆地生命进化中的防水作用外, 这些脂类的分离还有助于研究化学通信的进化模式和机制。在一种应用的方法中, 这种基于皮肤的线索对于处理入侵物种的野生动物管理者有潜在的用途。在这里介绍的协议中, 对爬行动物皮肤脂质进行定量的主要步骤包括提取、总脂质测定和通过柱层析进行分馏, 后者过程中的化合物可以纯化, 然后可以或者进行分析以分配化合物鉴定 (例如, 气相色谱-质谱联用) 和/或直接用于更精细的生物鉴定。皮肤脂类可以从活着的皮肤、脱落的皮肤或死亡的整个动物中提取, 使用非极性有机溶剂 (例如, 已烷、苯、甲苯)。萃取溶解脂质, 然后, 溶剂可以蒸发, 产生可测量的纯脂提取物。分馏包括通过传统柱层析将总脂质提取物分离成特定的脱液物。总脂质提取物首先与一个基于层的柱 (如氧化铝) 结合, 然后, 在特定体积上, 溶剂的单个提取物 (“分数”) 依次通过该柱传递到脂质混合物中的化合物集合基于共同的极性。通过增加极性溶剂 (如乙醚) 在非极性溶剂中的相对数量, 在极性序列中的极性过程中, 分数在极性中取得了进展。在本稿中, 我们描述了几种提取爬行动物皮肤脂质的方法, 然后, 利用传统的柱层析法, 提供了一种基于极性的不同化合物集的标准分离协议。因此, 全脂提取物或特定组分可用于生物检测, 以确定其中的化合物所产生的任何生物活性。
爬行动物直接从皮肤细胞或用于社会交流的离散腺体, 如配偶评估和跟踪、地域性以及种内和种间识别 1, 2,在表皮产生脂质 ,3,4。这些皮肤脂类的分离除了了解脂质在陆地生命进化中的防水作用外, 还有助于研究化学通信的进化模式和机制. ,4。此外, 许多爬行动物, 特别是鳞状动物 (蜥蜴、蛇), 是敏感生态系统中关注的入侵物种, 目前正在开发基于信息素的诱饵, 以改善诱捕和清除.爬行动物皮肤的不透性有利于提取存在的脂质, 以获得相对纯净的化学信号来源的提取。该方案中对爬行动物皮肤脂质进行定量的主要步骤包括提取、总脂质测定和通过柱层析 1、6、7进行分馏. 这些方法被例行使用, 因为它们产生的生物活性分离物解释了很多关于配偶的选择和选择, 特别是在蛇2中。
皮肤脂质可以从活着的皮肤, 脱落的皮肤, 或死亡的整个爬行动物,使用非极性或极性有机溶剂1,7,8,9。应当指出, 储存在乙醇等溶剂中的博物馆标本并不适合提取皮肤脂质, 只有新鲜或新鲜冷冻的尸体才应被视为可能的提取来源。皮肤脂质是惰性的, 这使得它们在皮肤表面很稳定, 容易提取7。在爬行动物生态学中, 皮肤脂质提示通常沉积在恶劣的环境中, 但由于其强大的化学特性, 这些线索可以在很长一段时间内保留其信息价值10,11,12. 提取过程中使用非极性溶剂 (例如已烷、苯、甲苯) 浸泡一小时, 然后将溶剂蒸发, 使脂质溶解, 从而留下可测量的脂质萃取物7,8. 皮肤脂质在非极性溶剂中具有很高的混溶性, 可以从类似的各种来源中提取各种碳氢化合物。
分馏比提取更费力, 但有助于通过柱层析将总脂质提取物分离到特定的组分中, 以帮助纯化和可能识别其中的化合物 1,6,7.,8. 总脂质提取物与一个基于子层的柱结合, 然后, 在特定体积的溶剂的单个提取物 (“分数”) 依次通过该柱, 从具有共同的脂质混合物中提取化合物集。极性6,7,8。在脂质色谱中, 通过增加极性溶剂 (如乙醚) 在非极性溶剂中的相对含量 (通常以百分比表示: 0%、2%、4% 乙醚等), 在极性中的极性过程中呈一定的标准化序列。)6,7,8。虽然薄层色谱 (tlc) 等方法可用于分离混合物中的脂类, 而且更简单, 但柱层析是首选, 因为它使用的是一个封闭的系统, 易于控制, 可以分离更浓缩的混合物, 并且与多路复用的效率。在本稿中, 我们描述了几种提取爬行动物皮肤脂质的方法, 然后, 利用传统的柱层析法, 提供了一种基于极性的不同化合物集的标准分离协议。在许多涉及化学线索隔离的研究项目中, 最终目标是改变暴露在这些线索下的接收机。因此, 全脂提取物或特定组分可用于生物检测, 以确定其中的化合物 1、2、6、7所产生的任何生物活性。例如, 在基础生物研究中, 使用特定分数的生物检测可以向研究人员揭示信息素的纯化源已经被分离, 然后, 可以采用目标化合物的鉴定方法。从野生动物管理的角度来看, 识别可能不是目标, 相反, 活性分数可以在野外使用, 以吸引物种到陷阱或抑制在非本地栖息地 13,14的配偶跟踪。
爬行动物中皮肤脂质的提取可应用于活皮或死皮, 此外还可用于脱落的皮肤, 这在这一技术的实验应用中提供了多功能性。此外, 皮肤脂质的提取可以在现场进行, 以便能够动态地将该方法应用于广泛的生物学家2,13。皮肤脂质提取简单;因此, 根据每个实验或设计的需要, 可以很容易地扩展提取, 并且从业者不需要有大量的专业知识来执行这些方法。扩大规模的唯一限制因素是烟罩空间的可用性、丰富的清洁、可密封的玻璃器皿和溶剂存储空间。
皮肤脂质提取物分馏可以根据研究人员的需要进行定制, 因此具有与脂质提取相似的灵活性。例如, 中性脂类可以洗脱, 然后丢弃, 从而产生目标分数, 从而净化感兴趣的化合物或简化生物检测。分馏可以在脂质样品内和脂质样本之间的多个尺度上进行。例如, 可以同时运行多个列, 以提高过程的效率。或者, 只有一部分的总脂质提取物可以分馏在一个小的列, 从而, 备用试剂和时间。分馏主要受到总脂质提取物质量和研究人员可用设备精度的限制。例如, 如果研究人员的天平为10.0 毫克, 则确定分数质量, 从而显著 (如果不是完全) 阻碍 gc-ms 分析样品制备的准确性。玻璃器皿也是如此。如果研究人员有一个大体积的分馏柱, 但有一个小的总脂质用于分离, 则化合物的洗脱或分离将会进行, 但需要大量浪费溶剂、试剂、时间, 以及潜在的目标复合自己。
建议在确定洗脱方案之前进行质量控制检查, 如表 2所示, 并决定可以丢弃哪些分数。为了确认所需脂质的洗脱, 可以运行一个柱, 其中每个分数, 1-15, 单独收集, 然后使用 gc-ms 进行分析。在图 3中, 具有代表性的气相色谱图痕迹显示, 加尔蛇的甲基酮只在特定的分数中从色谱柱中提取。通过执行这一质量控制步骤, 可以为特定物种制定改进的洗脱方案, 以确保感兴趣的化合物的最大产量。材料的变化, 如氧化铝的供应商或大量的制造商或乙醚的年龄, 将绝对导致洗脱的差异, 应通过进行质量控制测试来控制。
所描述的技术主要受到可以获得的线索的化学性质的限制。首先, 这些方法只能让研究人员从爬行动物的皮肤中分离出长链脂质。许多种类的爬行动物使用空气中的和/或蛋白质的线索作为化学信号, 并且所描述的方法与隔离表示的线索是不相容的。此外, 非极性溶剂不会从爬行动物表面或线索沉积来源 (例如, 网箱水、粪便物质、水生基质) 中提取可能确实含有丰富化学信号的水线索。研究人员可以使用适当的方法来捕获这些类型的线索 (例如, 用于挥发性线索的固相微萃取 [spme] 和用于水线索的高效液相色谱 [hplc]), 尽管与这些方法一样上面描述的, 有一个技术学习曲线。
最重要的是, 最终化学混合物对研究人员的效用应指导所使用的方法。例如, 如果研究人员想知道雄性焦点动物是否能区分有针对性的生物测定中雄性与雌性动物产生的线索, 那么提取是唯一需要的方法是 2,3.如果以性二态化合物的鉴定为目标, 则应将提取物纯化, 以便能够更有信心通过化学分析1将鉴定权分配给特定分子或分子群, 6,9,11。然而, 即使是以脂源进行色谱, 也需要大量的起始提取物, 才能获得可测量的分数质量;否则, 可以进行样本的汇集, 但不是最佳的 14。
该议定书的未来发展包括采取措施, 利用和调整该程序, 以更多的爬行动物物种。另外, 提取皮肤脂质的无创方法也在开发中。
The authors have nothing to disclose.
这些方法的发展, 特别是脱落皮肤脂质提取, 发生在合作协议 (14-7412-1061-ca, 15-7412-11155-ca, 和 16-7412-1269-ca) 之间的詹姆斯麦迪逊大学 (jmu) 和美国农业部动物和植物卫生检查服务 (aphis)。m. r. p. 感谢下列学生对脱落皮肤方法的发展所作的贡献: s. patel (华盛顿和李大学 [wlu])、j. zachry (wlu)、r. flores (jmu)、j. noll (jmu) 和 s. ashton (ju)。
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |