파충류, 피부 지질 conspecifics에서 성적 신호 침입 종 관리에서 잠재적인 사용에 대 한 중요 한 있습니다. 우리가 헛간 피부 또는 전체 동물에서 피부 지질을 추출 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 여기, 결정 및 총 지질 질량 분석 및 분류를 통해 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여 지질을 분리.
파충류 conspecifics 친구 추적 및 평가에 주로 그들의 피부에 지질을 사용 하 여 신호. 이러한 지질 격리는 진화 패턴 및 지질 지구 생명의 진화에서의 방수 역할을 이해 하는 것 외에도 화학 통신의 메커니즘에 초점을 맞춘 연구에 유틸리티가 있습니다. 적용된 방법에서는 이러한 피부 기반 신호 침입 종으로 취급 하는 야생 동물 관리자에 대 한 사용 가능성 있다. 여기에 제시 된 프로토콜에 파충류 피부 지질을 측정 하는 주요 단계 추출, 총 지질 결정 및 분류를 통해 열 착 색 인쇄기, 다음에 할 수 있는 화합물의 순화 있다 결과 후자의 과정 포함 중 복합 신원 (예를 들면, 가스 크로마토그래피-질량 분석 [GC-MS])을 지정 하려면 분석 될 또는 더 세련 된 생물 검정에 직접 사용. 피부 지질 생활 피부에서 추출 될 수 있다, 피부, 또는 전체 죽은 동물, 비 극성 유기 용 매 (예를 들어, 헥 산, 벤젠, 톨루엔)를 사용 하 여 창 고. 추출 solubilizes 지질 그리고, 다음, 용 매 측정 지질 전용 추출을 증발 수 있습니다. 분별에 전통적인 칼럼 크로마토그래피를 통해 특정 있다 총 지질 추출의 분리를 포함 한다. 총 지질 추출 물 (예를 들어, 알 루미나) 기판 기반 열에 바인딩되어 먼저 하 고, 다음, 용 매 특정 볼륨에서의 개별 있다 (“분수”) 열 elute 지질 혼합물에서 화합물의 집합을 통해 순차적으로 전달 됩니다. 일반적인 극성을 기반으로 합니다. 비 극성 용 매에서 극 지 용 매 (예를 들어, diethyl 에테르)의 상대적인 양을 증가 하 여 표준화 된 시퀀스에 극성에 분수 진행. 이 원고에서 우리 파충류의 피부 지질을 추출 하기 위한 여러 가지 방법을 설명 하 고, 다음, 제공 표준 프로토콜 기반 극성 화합물의 다른 세트를 격리 하기 위한 전통 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여. 전체 지질 추출 또는 특정 분수 사용할 수 있습니다, 다음, 생물 검정에는 화합물에 의해 거기에 elicited 어떤 생물 학적 활동을 결정 하.
파충류에 표 피, 피부 세포에서 직접 또는 동료 평가 추적, 세력권이, 내부-그리고 interspecific 인식1,2 등 사회적 통신에 사용 되는 개별 동맥에서 지질 생산 ,,34. 이러한 피부 지질 격리는 유틸리티 진화 패턴 및 지질 지상파2,3의 진화에의 방수 역할을 이해 뿐 아니라 화학 통신의 메커니즘에 초점을 맞춘 연구에 ,4. 또한, 많은 파충류 squamates (도마뱀, 뱀), 특히 민감한 생태계에 관심사의 침략 적인 종 그리고 페로몬 기반 미끼 트랩 및 제거 향상의 개발은 지속적인5,6. 파충류 피부의 불 침투성의 화학 신호의 잠재적으로 강력한 소스의 비교적 순수한 기사를 현재 지질 추출 용이. 설명된 프로토콜에 파충류 피부 지질을 측정 하는 원리 단계 추출, 총 지질 결정 및 분류를 통해 열 크로마토그래피1,,67포함 됩니다. 방법을은 정기적으로 그들은 많은 메이 트 선택과 뱀2에 특히 선택에 대해 설명 하는 생리 활성 격리 항복으로 사용 되었습니다.
피부 지질 생활 피부, 헛간 피부, 또는 비 극성을 사용 하 여 죽은 모든 파충류 또는 극 지 유기 용 매1,7,,89에서 추출할 수 있습니다. 박물관 표본 에탄올 같은 용 매에 저장 된 피부 지질 추출에 최적 되지 않습니다 고만 싱싱한 갓 냉동 시체 추출 위한 가능한 근원으로 고려 되어야 한다 주목 한다. 피부 지질은 불활성,이 그들이7추출 하기 쉬운 피부를의 표면에 안정적인 게. 파충류 생태에서 그들의 신호 역할, 피부 지질 신호는 가혹한 환경에서 입금 자주 하지만 그들의 강력한 화학 특성 때문에 이러한 신호 수 시간10,11 의 오랜 기간 동안 그들의 정보 가치를 유지 , 12. 추출 과정 지질 추출7 의 측정 질량을 두고 솔벤트의 증발에 의해 다음 시간 동안 흠뻑 젖어 통해 지질, 비 극성 용 매 (예를 들어, 헥 산, 벤젠, 톨루엔)를 사용 하 여 solubilizes , 8. 피부 지질은 매우 비 극성 용 매에 혼합할 수 있는 마찬가지로 다양 한 소스에서에서 다양 한 탄화수소를 추출할 수 있습니다.
분류 추출 보다 더 힘 드는입니다 하지만 특정 분수를 통해 열 착 색 인쇄기, 화합물의 정화 및 가능한 식별에 도움이 거기에1, 로 총 지질 추출 분리 하는 역 6 , 7 , 8. 총 지질 추출 기판 기반 열에 바인딩되어 있고 다음, 용 매 특정 볼륨에서의 개별 있다 (“분수”) 열 elute 일반적인 있는 지질 혼합물에서 화합물의 집합을 통해 순차적으로 전달 됩니다 극성6,,78. 지질 크로마토그래피, 일부 극성에 분수 진행 비 극성 용 매에서 극 지 용 매 (예를 들어, diethyl 에테르)의 상대적인 양을 늘려 시퀀스 표준화 (일반적으로 백분율로 표시: 0%, 2%, 4% 에테르, 등. )6,,78. 방법 처럼 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 지질 혼합물에는 간단 하 게 분리 하는 데 사용할 수 있습니다, 열 착 색 인쇄기는 제어, 수 쉽습니다 선호 하는 닫힌된 시스템을 사용 하기 때문에 별도 더 집중 혼합물, 고 호환 효율성에 대 한 다중화 한다. 이 원고에서 우리 파충류의 피부 지질을 추출 하기 위한 여러 가지 방법을 설명 하 고, 다음, 제공 표준 프로토콜 기반 극성 화합물의 다른 세트를 격리 하기 위한 전통 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여. 화학 신호의 격리와 관련 된 많은 연구 프로젝트에 궁극적인 목적은 그 단서에 노출 하는 수신기에 효과 변화입니다. 전체 지질 추출 또는 특정 분수, 사용할 수 있습니다 생물 검정에서 어떤 생물 활성 화합물에 의해 elicited1,2,,67거기에 결정을. 기본적인 생물학 연구, 예를 들어 특정 분수를 사용 하 여 생물 검정 밝힐 수 있다 연구는 페로몬의 순화 소스 고립 되었으며 다음, 대상 화합물의 식별을 위한 방법 추구 될 수 있습니다. 야생 동물 관리 관점에서 식별 목표, 되지 않을 수도 있습니다 그리고 대신, 활성 분수 사용할 수 필드에 트랩 conspecifics를 유치 또는 억제 nonnative 서식 지13,14에서 추적 하는 친구.
파충류의 피부 지질 추출 헛간 피부,이 기술 실험 적용에 다양성을 제공 이외에 생활 또는 죽은 피부에 적용할 수 있습니다. 또한, 피부 지질 기사 생물학2,13의 다양 한 방법의 동적 응용 프로그램을 사용 하는 필드에서 수행할 수 있습니다. 피부 지질 추출은 간단 하다; 따라서, 그것은 쉽게 실험 또는 디자인, 필요에 따라 추출 최대 규모 이며 실무자 메서드를 실행 하려면 상당한 전문성을 가질 필요가 없다. 확장에 대 한 유일한 제한 요소는 연기 후드 공간의 가용성, 깨끗 한, 접착성 유리와 용 매 저장 공간입니다.
피부 지질 추출 분류 연구자의 요구에 맞게 수 있으며, 따라서, 지질 추출에 비슷한 유연성. 예를 들어, 중립 지질 eluted 고 후 삭제, 대상 분수 관심사의 화합물을 정화 하거나 단순화 생물 검정에서에서 결과. 분류 및 지질 샘플에서 여러 스케일에서 수행할 수 있습니다. 예를 들어 여러 열 보다 효율적으로 프로세스를 동시에 실행할 수 있습니다. 또는, 총 지질 추출의 단지 부분에, 따라서, 시 약 및 시간 작은 열에 fractionated 수 있습니다. 분류 총 지질 추출의 질량 및 연구원 수 장비의 정밀도 의해 주로 제한 됩니다. 예를 들어 있으면 연구원 10.0 mg 정밀도, 분수의 균형 질량 및, 따라서, GC-MS 분석을 위한 시료 준비의 정확성은 크게, 아니라면 완전히 장애가. 유리는 마찬가지입니다. 연구원 분류에 대 한 대규모 열만 별도로 작은 총 지질 질량, 경우 차입 또는 화합물의 분리 진행 된다 하지만 용 매, 시 약, 시간, 및 잠재적으로, 대상의 중요 한 소모를 요구할 것 이다 스스로 화합물.
표 2에서 보듯이 차입 계획을 결정 하기 전에 품질 관리 검사를 수행 하 고 어떤 분수 삭제 될 수 있습니다 결정 하는 것이 좋습니다. 원하는 지질, 열의 차입을 확인 하 수 있습니다 실행 각 분수, 1-15를 개별적으로 수집 하 고 다음 분석 하는 어디 사용 GC-MS. 그림 3에서는 대표적인 가스 크로마 토 그래프 추적이 터 훈장 뱀이에서 메 틸 케 톤만에 특정 열에서 elute 보여줍니다. 이 품질 관리 단계를 수행 하 여 관심의 화합물의 최대 수익률을 보장 하기 위해 특정된 종족에 대 한 수정 된 차입 계획을 개발할 수 있습니다. 공급 업체 또는의 많은 diethyl 에테르의 나이 등 재료에 변화 차이 대 한 품질 관리 테스트를 수행 하 여 제어 해야 하는 차입에 절대적으로 발생 합니다.
설명 된 기술은 얻을 수 있는 단서의 화학 본질에 의해 주로 제한 됩니다. 주로, 이러한 메서드는만 연구원 분리 하 고 긴 체인 지질 파충류의 피부에서 분리 수 있습니다. 많은 종의 파충류 화학 신호로 공 수 및 배치할 신호를 사용 하 고 설명된 방법 분리 했다 단서와 호환 되지 않습니다. 또한, 비 극성 용 매 하지 파충류의 표면 또는 큐 증 착의 (예를 들어, 케이지 물, 대변, 수생 기판) 참으로 풍부한 화학 신호를 포함할 수 있는 소스에서 수성 신호를 추출할 것 이다. 비록, 이러한 유형의 신호 캡처에 대 한 적절 한 메서드 (예를 들어, 고체 상 미 [SPME] 휘발성 신호를 고성능 액체 크로마토그래피 [HPLC] 수성 단서), 연구원에 게 사용할 수 있습니다 같은 방법 위에서 설명한 기술 학습 곡선입니다.
가장 중요 한 것은, 연구원을 최종 화학 혼합물의 유틸리티 사용 방법을 안내 한다. 예를 들어 연구원 경우 남성 초점 동물 대상된 생물 검정에 남성 대 여성 conspecifics를 제작한 신호를 구별할 수 있습니다 알고 싶다면, 추출 하는 유일한 방법 필요한2,3입니다. 그러나 성적으로 동종이 형 화합물의 식별 목표 하는 경우에,, 추출에 게 서, 특정 분자 또는 분자를 통해 화학 분석1,의 그룹에 식별 할당에 큰 자신감 수 있도록 정화 6,,911. 그러나, 심지어 지질 소스와 크로마토그래피를 실시, 추출 시작의 중요 한 대량은 필요 측정 분수 질량은 얻어질 수 있다; 그렇지 않으면, 샘플의 풀링 추구 될 수 있지만 최적의14아니에요.
이 프로토콜의 미래 개발 활용 하 고 더 많은 파충류 종에 대 한 절차를 적용 하는 조치를 포함 합니다. 피부 지질을 추출의 추가 비 침 투 적인 방법 또한 개발 되고있다.
The authors have nothing to disclose.
이 방법, 특히 창 고 피부 지질 추출의 개발 중에 발생 한 제임스 매디슨 대학 (JMU)와 미국 농 무부 동물 사이 협력 계약 (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA, 및 16-7412-1269-CA) 과 건강 검사 서비스 (진딧물) 공장. 창 고 스킨 방법의 개발을 다음 학생 들의 기여를 인정 하는 M.R.P.: S. 파 텔 (워싱톤과이 대학 [WLU]), 제이 Zachry (WLU), R. 플로레스 (JMU), J. Noll (JMU), 그리고 미 애쉬 튼 (JMU).
Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |