Biz yüksek üretilen iş Caenorhabditis elegansbüyük popülasyonlarda fenotipik karakterizasyonu sağlayan geniş görüş alanı nematodunun izleme platformu (WF-NTP) kullanarak iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller mutant suşları veya yüksek ölçeklenebilir bir moda farmakolojik tedaviye yanıt ince davranış değişiklikleri tanımlamak için kullanılabilir.
Caenorhabditis elegans Biyomedikal araştırma, yaygın olarak işlevsel genomik ve yaşlanma çalışmaları istihdam iyi kurulmuş bir hayvan modeli var. Sağlık ve fitness altında eğitim hayvanların değerlendirmek için bir genellikle vücut viraj sayısı veya dolaşım hızı ölçümü gibi hareketliliği dökümanları kullanır. Bu ölçümler genellikle el ile sayım içeren, yapım o zaman iyi istatistiksel anlamlılık elde edilir ve kısıtlamaları kez emek zorlu sınırı her deneyde 25 veya daha az hayvan sayısı. Yüksek istatistiksel güç tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek ve ne zaman zayıf fenotipik etkileri incelenmiştir yanlış pozitif ve negatif sonuçlar sınırlamak için gerekli olduğundan, çabaları son zamanlarda otomatik protokolleri artırılması üzerinde duruldu geliştirmek için yapılmıştır hareket algılama ve çok parametrik davranış profil. duyarlılık Biz burada 5. 000’e kadar bireysel hayvanların çalışma sağlar bir teknolojik gelişme algılama çoğu kez genetik çalışmalar ve ilaç keşif önemli küçük fenotipik değişiklikleri yakalamak için gerekli seviyeye sınırını genişletmek için tarif aynı anda, istatistiksel ölçümler tarafından gücünü artırarak yaklaşık 1000 kat daha fazla karşılaştırıldığında için el ile testleri ve yaklaşık 100-fold diğer kullanılabilir otomatik yöntemlerine göre.
Yaklaşık yarım yüzyıl önce Sydney Brenner Caenorhabditis elegans (C. elegans) geliştirme ve Nörobiyoloji, bu küçük olarak çalışmaya bir modeli sistem olarak tanıttı (1 mm içinde uzunluk), şeffaf yuvarlak solucan işlemek kolay Genetik ve laboratuvar1‘ korumak için. Bugün, C. elegans çok çeşitli dahil apoptosis, hücre sinyallemesi, hücre döngüsü, gen düzenlemesi, metabolizma doğası ve2yaşlanma biyolojik süreçlerin incelemek için kullanılır. Ayrıca, cep ve doku karmaşıklığı, protein ifade desenleri ve hastalık yolları C. elegans ve (solucan genlerin % 80’i var bir insan orthologue) daha yüksek organizmalar arasında koruma sadeliği ile bağlantılı ve maliyet-etkililik ekimi, yapmak o bir etkili vivo içinde model organizma mükellef yüksek üretilen iş genetik3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ve uyuşturucu14,15,16 gösterimleri. Tüm bu nedenlerden dolayı C. elegans normal ve hastalığı ile ilgili moleküler yolları karakterizasyonu için istihdam edilmiştir; ateş alanında, örneğin, protein toplama3,4,7,15,17yaşlanma etkilerini keşfi editörünü, 18ve organizatör karakterizasyonu ve inhibitörleri protein toplama3,4,5,6,7,14, 18.
Çalışma bu tür tanımlanmış olması önemli bir davranış parametresi olan genel sağlık solucanların, el ile çeşitli şekillerde, gibi vücut kıvrımları dakika (BPM)4,6, başına sayılması tarafından ölçülebilir 19, ya da hareket20,21,22hızını ölçme yanı sıra tarafından ortalama ömrü ve felç oranları ölçmek. El ile ölçümleri vücut kıvrımları ve dolaşım hızı moleküler yolları ve mekanizmaları3,4,14,19çeşitli birçok önemli anlayışlar açmıştır rağmen 20,23, el ile testleri kalır şu anda düşük işlem hacmi, son derece emek ve zaman alıcı iken hataları ve insan önyargıları eğilimli olma. Bu sorunları önemli sorunlar ince davranış değişiklikleri ayırt etmek için yeterli istatistiksel gücü ile veri koleksiyonunda mevcut. Bu sınırlama tedaviler potansiyel ilaç molekülleri genellikle küçük fenotipik değişiklikler24için yol olarak eleme, bu nedenle tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için hayvanlar çok sayıda çalışma gerektiren bir uyuşturucu için özellikle uygundur. Bu noktada göstermek için son yıllarda yapılan çalışmalarda algılama (POD) yüksek bir güç ve güven ile önemli bir değişiklik davranışını tanımlamak için yanlış pozitif sonuçlar25gerekli olduğunu göstermiştir. Bu el ile yeniden oluşturulabilir, otomatik, zaman – ve cost – effective ölçümleri ile sayma değiştirmek için güçlü bir motivasyon C. elegans toplumda sonuçlandı. Bu talebi karşılamak için çeşitli Laboratuvarlar son zamanlarda yüksek-duyarlı ölçümler ve doğru solucan solucanlar22,26,27,28 sayıda izlenmesine yönelik yöntemler geliştirdik ,29,30,31,32,33.
Amacıyla daha da istatistiksel olarak anlamlı ölçülerini gerekli hayvanların büyük tabur için Otomasyon işlemi genişletmek için biz son zamanlarda platformu (WF-NTP)15,34 izleme bir geniş görüş alanı Yuvarlak solucanlar geliştirdik ,35,36çok büyük solucan nüfus üzerinde birden çok fenotipik dökümanları, istatistiksel olarak ilgili phenotypical algılama25önemli bir faktör aynı anda incelenmesi sağlar,. Sadece WF-NTP Şu anda paralel 5. 000’e kadar hayvanlar izleyebilirsiniz, ancak fenotipik dökümanları da oranı ve genlik vücut kıvrımları, ve hareket hızı, felç olduğunu, nüfusun kısmı da dahil olmak üzere birden çok parametre içerir ve hayvanlar boyutu. Bu nedenle kolayca ekran binlerce Worms paralel ve farklı sonuçlar bir çok boyutlu parmak izi36oluşturmak için davranışsal bir harita birleştirmek için mümkündür. İlişkili açık kaynak yazılım da bunu çalıştırmak için gereklidir ve tamamen özelleştirilebilir Python ile yazılmış. Kullanıcıların bu teknoloji benimsenmesi bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) mevcuttur.
Burada, bir dizi bazı WF-NTP potansiyel uygulamalar göstermek protokolleri mevcut. Özellikle, bileşiklerin küçük moleküllerin protein therapeutics için değişen yönetim tartışmak ve böylece etkili bir şekilde küçük örnek için ihtiyaç kaldırarak solucanlar, büyük nüfus üzerinde doğrudan etkileri ekran olarak tarif alt nüfus. Böyle bir amaç için kullanılması, WF-NTP zaten Alzheimer hastalığı (Ah)15,34,35 ve Parkinson hastalığı (PD)18 ilaç bulma programları tasarlamak için hedef alan yordamlarda önemli avantajlar getirdi tedavi edici adaylar35,37değerlendirmesi için içinde vivo verileri kullanarak.
Teknikleri optik bilimler alanındaki hızlı genişleme nedeniyle, şimdi önemli ölçüde yeni yollarla otomatik yöntemleri C. elegans çalışmalarda gereksinimini gidermek mümkündür. Sonuç olarak, dijital platformlar20,41,42,43,44,45,46 izleme bir dizi tasarlanmış ve üzerinde kullanılabilir Son birkaç yıldır ve hareket, frekans, felç oranı gibi davranışların omega döner ve ömrü ölçümleri gibi daha karmaşık formlar bükme hızı gibi parametreleri elle saymak yerine için. En son otomatik platformlar tekrarlanabilirlik büyük ölçüde düzeldi ve C. elegans duyarlılığını41 çalışmalar ve yüksek kalitede veri küçük tabur veya bile bireysel hayvanlar üzerinde sağlanan. Biz de bin-in hayvan paralel tabur fenotipleri değerlendirmek mümkün kılmak için solucan davranış analizi Otomasyon uzatma kararı aldı. Solucan tabur eğitim yaklaşımı en büyük avantajı bu solucan davranış24 yüksek iç değişkenliği ve ilaç tedavisi araştırmaları, sık sık olan ince fenotipik varyasyonları için yol aslında hesap oluşturma için sağlanmıştır küçük bir grup hayvan kullanırken yeterli istatistiksel anlamlılık ile tespit etmek zor. Algılama (POD) yüksek gücünü gerçekten güven ile herhangi bir önemli değişiklik davranışlara algılamak ve yanlış pozitif sonuçlar25sınırlamak için gereklidir.
Burada, bir dizi son zamanlarda bildirilen otomatik tarama yöntemi üzerinde C. elegansiçin geniş görüş alanı Yuvarlak solucanlar platformu (WF-NTP)36izleme tabanlı protokol anlatmıştık. Burada açıklanan protokol 5 bölüme ayrılmıştır. Parçalar 1 ve 2 büyük solucan nüfus hazırlanması açıklar. Çalışma koşulları kısırlık ve reaktifler ve levha deneyler çalıştırmak için gereken hazırlanması önemli adımlardır. Biz diğer yöntemleri36eleme karşılaştırıldığında bu protokol tarafından sağlanan artan işlem hacmi nedeniyle, bu da reaktifler artan miktarlarda, gerekir; Bu faktör deneysel tasarım dikkatle düşünülmesi gerekir. Ayrıca ağartma adım önemlidir ve önceden çok sayıda yumurta test edilmesi gerekiyor ve sağlıklı larvalar bu deneyler çalıştırmak için gerekli olan dikkat edin. Bu iletişim kuralı parçası 3 katı ortam ve ekran solucan uyuşturucu nüfus sunmak nasıl ayrıntılı. Bu protokolün bir parçası güçlü ilaçlar ve ilaç konsantrasyonları paralel olarak Kullanıcı tarafından test edilecek sayısına bağlı olduğunu unutmayın. Prosedürü ve hızlı veri toplama tam otomasyon davranış gözlem reaktif hazırlık ve büyüme ve büyük solucan nüfus eşitlenmesi için sınırlayıcı adım kaydır. Anahtar davranış tarama sırasında kayıt ve herhangi bir solucan adımlar (Örneğin, izleme platformu NGM plakalar üzerinden solucanlar transferi) işleme zamanlamaları adımlardır. Burada açıklanan protokolü 9 gün yetişkin ömrü sırasında için solucanlar ekran için tasarlanmış bir örnektir; Ancak, bu iletişim kuralı Kullanıcı, örneğin, 18 gün üst üste36istediği kadar zaman sayı ekran kolayca adapte edilebilir. Bölüm 4 sonra protein molekülleri (örneğin, antikorlar ve moleküler chaperones) teslim etmek için Uygulama Protokolü’nün C. elegansve nasıl parçalar 1-3 resimli Protokolü kolayca, istenen bağlı olarak özelleştirilebilir gösterir gösterir uygulama. Biz nasıl bu yordam sadece uyuşturucu benzeri moleküllerin aynı zamanda moleküler chaperones veya antikorlar37yönetim için teslimat için Genişletilebilir göstermek. İlk dört adımları (parçalar) steril koşullarda, aksi belirtilmediği sürece devam etmektedir. Tüm sıvı bileşenleri kullanılmadan önce autoclaved olmalıdır ve %70 bağıl nem kuluçka adımlar gerçekleştirilmelidir. Bölüm 5, biz nasıl izleme sahne ile birlikte sağlanan yazılım paketi kullanıldığını açıklar. Bu yazılım büyük solucan nüfus davranışını ilgili WF-NTP veri analizi için tasarlanmış özel olmuştur. Kullanıcı veri analizi için Bölüm 5’te sağlanan yönergeleri takip öneririz; Ancak, bu parametreler (yani, fps, görüş alanı, video çözünürlüğü, alınan çerçeve sayısı) Kaydedilen videoların belirli özelliklerine bağlıdır. GUI içinde sağlanan örnek işlevini doğru parametrelerin analiz önce değerlendirilmesi kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
Bu dizi protokol eserler nedeniyle hayvanlar davranışını içsel değişkenliği azaltmak C. elegans büyük popülasyonlarda (Şu anda en paralel 5000 bireysel solucanlar) fenotipleri etkili bir şekilde analiz etmek mümkün hale , ile anlaşma algılama çalışmaları C. elegans25için istatistiksel anlamlılık elde etmek için gerekli gücü üzerinde ön çalışmalar. Platform yüksek çözünürlüklü kamera, görüntüleri hayvanlar yüksek hızda, çok sayıda aynı anda birden çok büyük tabur kaydederken kaydedebilen bir sistemi kullanır. Yüksek performans ve yüksek akış verimi WF-NTP iletişim kuralı, çok küçük değişiklikler solucan davranış çok doğru bir şekilde belirlemek mümkün kılar. Bu nedenle, bu yöntemi sadece C. elegansbiyoloji çalışma için ama Ayrıca genetik değişiklikler ve uyuşturucu ile yüksek-den geçerek taranması gibi farmakolojik ve tıbbi araştırma için dikkate alınması gereken yeni yaklaşımlar sağlar tedaviler. Bu yordam Ayrıca felç çalışmalar yapılması diğer davranışsal ölçümler ile paralel, moleküler tarama çalışmalarında önemli bir özelliği sağlayan avantajı vardır.
AD15,34,35 ve PD18 ilaç keşif programlarında defa elde sonuçları geniş görüş alanı veri toplama önemli ölçüde artan önemini göstermek numaraları hayvanların önemli ölçüde deneysel hataları azaltmak ve büyük ölçüde çalışmaların istatistiksel geçerliliği iyileştirilmesi tek bir deney izlenebilir. Bu protokol için açıklanan geçerli yaklaşım ilaç keşif alanındaki sorunları ele odaklanmıştır, biz metodoloji toplumda yaygın olarak kabul edileceğini ve uygulanması karmaşık genetik uzun olabilir umuyoruz ve davranışsal çalışmalar ve şu anda tespit fenotipleri sayısını artırmak.
The authors have nothing to disclose.
Bu iş merkezi tarafından Misfolding hastalıklar (CMD) için destek verdi. FAA kıdemli araştırma bursu ödülü Alzheimer Derneği, İngiltere’de (Grant sayı 317, AS-SF-16-003) tarafından desteklenmektedir. C. elegans suşları Caenorhabditis elegans genetik Merkezi (CGC) elde edilmiştir.
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |