Мы описываем протоколы для использования платформы широкое поле зрения нематоды отслеживания (WF-NTP), которая позволяет высок объём фенотипические характеристики больших популяций Caenorhabditis elegans. Эти протоколы могут использоваться для характеризуют тонкие поведенческие изменения в мутантных штаммов или в ответ на медикаментозное лечение в масштабируемой моды.
Caenorhabditis elegans является устоявшейся животной модели в биомедицинских исследований, широко используемых в функциональной геномике и старения исследований. Для оценки здоровья и фитнеса животных под исследование, один обычно полагается на моторику отсчетов, такие как измерение количество изгибов тела или скорость движения. Эти измерения обычно включают ручной подсчет, что делает его трудно получить хорошее статистической значимости, как время и труд ограничения часто ограничивают количество животных в каждом эксперименте 25 или меньше. С высокой статистической мощности является необходимым для получения воспроизводимых результатов и ограничить ложные положительные и отрицательные результаты, когда слабый Фенотипическая воздействию исследованы, недавно были предприняты усилия для разработки автоматизированных протоколы, направлена на повышение чувствительность обнаружения моторики и несколькими параметрическими поведенческая Профайлинг. Для того чтобы расширить предел обнаружения до уровня, необходимого для захвата малых фенотипические изменения, которые часто играют решающую роль в генетических исследованиях и обнаружения наркотиков, мы опишем здесь технологического развития, который позволяет исследование до 5000 отдельных животных одновременно увеличивая статистической мощности измерения около Гарибова по сравнению с ручной анализов и около 100 раз по сравнению с других доступных автоматизированных методов.
Примерно полвека назад, Сидней Бреннер представил Caenorhabditis elegans (C. elegans) как модель системы для изучения развития и нейробиология, как этот маленький (1 мм в длину), прозрачный червя нематоды легко манипулировать генетически и поддерживать в лаборатории1. Сегодня C. elegans используется для изучения широкий спектр биологических процессов, включая апоптоза, сигнализации ячейки, характер клеточного цикла, регулирование гена, метаболизм и старения2. Кроме того клеточные и тканевые сложности, шаблоны выражение протеина и сохранению болезни пути между C. elegans и высших организмов (80% червь генов у человека orthologue), связанный с простотой и рентабельность выращивания, сделать его эффективным в естественных условиях организм модель поддаются высок объём генетических3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 и наркотиков14,,1516 фильмов. По всем этим причинам C. elegans был нанят для характеристики нормального и связанных с болезнью молекулярные пути; в поле нейродегенеративные например, это позволило изучение последствий старения белка агрегации3,4,7,15,17, 18и квалификация промоутеров и ингибиторы протеин агрегации3,4,5,6,7,14, 18.
Общая фитнес червей, который является важным параметром поведенческих должен быть определен в этот тип исследования, может быть измерен вручную в различных способов, таких как подсчитывать количество изгибов тела в минуту (BPM)4,6, 19, или путем измерения скорости движения20,21,22, а также путем измерения средняя продолжительность жизни и уровень паралич. Хотя ручного измерения изгибы тела и скорость движения привели к многие важные идеи в различных молекулярных пути и механизмы3,4,14,19, 20,23, ручной анализов остаются в настоящее время низкая пропускная способность, весьма трудоемким и длительным, находясь склонны к ошибкам и человеческого предубеждения. Эти вопросы представляют значительные трудности в сборе данных с достаточной статистической мощностью, чтобы различать тонкие поведенческие изменения. Это ограничение является особенно актуально для наркотиков скрининг как лечение с потенциальными наркотиков, что молекулы часто приводят к небольшой фенотипические изменения24, поэтому требующих изучения большого числа животных для того чтобы получить воспроизводимые результаты. Чтобы проиллюстрировать это, недавние исследования показали, что большой мощности обнаружения (POD) необходимо определить с уверенностью любые значительные изменения в поведении и ограничить25ложных положительных результатов. Это привело к сильной мотивации в C. elegans сообщество заменить ручной подсчет с измерений воспроизводимы, автоматизированный, время – и экономичным. Для удовлетворения этого спроса, несколько лабораторий недавно разработали методы для высокой чувствительности измерения и отслеживания точных червь большего числа червей22,26,27,28 ,,2930,,3132,33.
С целью дальнейшего расширения процесса автоматизации в большой когорты животных, необходимых для статистически значимых измерения, мы недавно разработали широкое поле зрения нематода, отслеживания платформы (WF-NTP)15,34 ,35,36, который позволяет одновременное исследование несколько фенотипических отсчетов на очень больших червь населения, является ключевым фактором в статистически значимым фенотипические обнаружения25. Не только может WF-NTP в настоящее время контролировать до 5000 животных параллельно, но фенотипические индикацию также включают в себя несколько параметров, включая скорость и амплитуду изгибы тела, скорость движения, доля населения, парализована, и Размер животных. Поэтому легко можно экран тысячи червей параллельно и объединить различные индикацию в поведенческих карту для создания многомерных отпечатков пальцев36. Связанные открытым исходным кодом программного обеспечения написана на Python, который также необходим для работы и полностью настраиваемый. Графический интерфейс пользователя (GUI) также предоставляет возможность пользователям принять эту технологию.
Здесь мы представляем ряда протоколов, которые иллюстрируют некоторые из возможных применений WF-NTP. В частности мы обсудим администрация соединений, начиная от маленьких молекул белка терапии и описывают, как экран их эффекты непосредственно над большим населением червей, таким образом, эффективно устраняя необходимость образец небольшой подгрупп населения. Использование WF-NTP для этой цели уже принесло значительные преимущества в процедурах, направленных для разработки программ обнаружения наркотиков болезни Альцгеймера (AD)15,,3435 и болезни Паркинсона (PD)18 с использованием в естественных условиях данных для оценки кандидатов-терапевтических35,37.
Из-за быстрого расширения методов в области оптических наук стало возможным удовлетворить требование для автоматизированных методов в C. elegans исследований существенно новыми способами. В результате были разработаны и доступны через ряд цифровых отслеживания платформы20,41,42,,4344,45,46 за последние несколько лет для того, чтобы заменить ручной подсчет параметров, таких как скорость движения, изгиб частоты, паралич курс, а также более сложных форм поведения, таких как Омега повороты и измерения жизни. Самые последние автоматизированные платформы значительно улучшили воспроизводимость и чувствительность C. elegans учится41 и высокое качество данных на малых групп или даже отдельных животных. Мы решили продлить автоматизации анализа червя поведение, чтобы сделать его также можно оценить фенотипов когорты тысяч животных параллельно. Главное преимущество подхода изучения когорты червь является, что она позволяет для учета высокая внутренняя изменчивость червь поведение24 и тот факт, что исследования наркотиков лечения часто приводят к тонкие фенотипические изменения, которые сложно определить с достаточной статистической значимости, когда с помощью небольшой группы животных. Высокая мощность обнаружения (POD) действительно необходимо обнаружить с уверенностью значительных изменений в поведении и ограничить25ложных положительных результатов.
Здесь мы описали ряд протоколов, основанных на методе недавно сообщили автоматизированной проверки для C. elegans, широкое поле зрения нематода, отслеживания платформы (WF-NTP)36. Протокол, описанные здесь делится на 5 частей. Части 1 и 2 описывают подготовку населения больших червя. Важнейшие шаги являются стерильности условий работы и подготовка реагентов и пластин, необходимых для выполнения экспериментов. Мы отмечаем, что, за счет увеличения пропускной способности, предоставленные настоящим Протоколом, по сравнению с другими отбора методологий36, она также требует увеличения количества реагентов; Этот фактор необходимо тщательно рассматривать в экспериментальный дизайн. Мы также отмечаем, что отбеливание шаг имеет решающее значение и должна испытываться заранее как большое количество яиц, и здоровых личинки необходимы для запуска этих экспериментов. Часть 3 настоящего Протокола сведения для доставки препаратов в твердых носителей и экран червь населения. Мы отмечаем, что эта часть протокола сильно зависит количество наркотиков и концентрации препарата быть проверен пользователем параллельно. Полная автоматизация процедуры проверки и быстрого сбора сдвиг ограничивающим шаг от поведенческие наблюдения Подготовка реагента и роста и синхронизации больших червь населения. Основные шаги в ходе скрининг являются тайминги записи и любой червь, обработка шагов (например, передача червей от NGM пластины для отслеживания платформы). Протокол, описанные здесь приведен пример предназначен для экрана червей до 9 дней в течение взрослой жизни; Однако этот протокол может быть легко адаптированы для экрана как много времени, как желания пользователя, например, 18 дней подряд36. Часть 4 затем иллюстрирует применение протокола доставить белковых молекул (например, антител и молекулярных сопровождающих) в C. elegansи показывает, как протокол, показано в части 1-3 можно легко настроить, в зависимости от желаемого приложения. Мы демонстрируем, как эта процедура может быть расширена, не только для доставки наркотиков как молекул, но и для отправления молекулярной сопровождающим или антител37. Первые четыре шага (части) проводятся в стерильных условиях, если не указано иное. Все жидкие компоненты должны быть газобетона до использования и инкубации шаги должны выполняться на 70% относительной влажности. В части 5 мы опишем, как использовать пакет программного обеспечения, в сочетании с этапа отслеживания. Это программное обеспечение было пользовательских предназначен для анализа данных WF-NTP, связанные с поведением населения больших червя. Мы предлагаем, что пользователь соответствует рекомендации, представленные в части 5 для анализа данных; Однако эти параметры зависят от конкретных особенностей записанные видео (то есть, fps, поле зрения, разрешение видео, количество приобретенных кадров). Следующий пример функции в графический интерфейс был разработан для облегчения оценки правильные параметры до анализа.
Эти серии протоколов позволяют анализировать фенотипов больших популяций C. elegans (в настоящее время до 5000 отдельных червей параллельно) эффективно, уменьшения артефактов вследствие внутренней изменчивости поведения животных , по согласованию с предварительные исследования по мощности обнаружения, необходимых для достижения статистической значимости для исследования C. elegans25. Платформа использует систему камер высокого разрешения, способна записывать изображения большого числа животных на высокой скорости, при записи одновременно несколько большие когорты. Высокая производительность и высокая пропускная способность протокола WF NTP делает его возможным определить очень небольшие изменения в поведение червя в очень точным образом. Таким образом эта методика позволяет новые подходы могут считаться не только для изучения биологии C. elegans, но дополнительно для медицинских и фармакологических исследований, например высокопроизводительного скрининга генетической модификации и наркотиков лечение. Эта процедура также имеет то преимущество, позволяя паралич исследования выполняться параллельно с другими поведенческие измерения, ключевой особенностью в молекулярной скрининговых исследований.
Результаты, достигнутые до настоящего времени в программах обнаружения наркотиков AD15,,3435 и PD18 продемонстрировать важность сбора данных широкого поля зрения в существенного увеличения количество животных, которые могут контролироваться в одном эксперименте, тем самым значительно уменьшается экспериментальной ошибки и значительно улучшение статистической достоверности исследований. Хотя нынешний подход, описанный в этом протоколе была сосредоточена на решении проблем в области лекарственных препаратов, мы надеемся, что методология будет широко принят в сообществе, и что его применение будет продлен до сложных генетических и поведенческие исследования и расширить количество фенотипов, которые в настоящее время обнаружено.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Центром по сворачиванию заболеваний (CMD). АВС поддерживается старший стипендия исследований Альцгеймера общества, Великобритания (Грант номер 317, AS-SF-16-003). Штаммы C. elegans были получены из Caenorhabditis elegans генетического центра (CGC).
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |