Descriviamo i protocolli per l’utilizzo della piattaforma di tracking del nematode ampio campo di vista (WF-NTP), che consente velocità effettiva elevata caratterizzazione fenotipica di grandi popolazioni di Caenorhabditis elegans. Questi protocolli possono essere utilizzati per caratterizzare i sottili cambiamenti comportamentali in ceppi mutanti o in risposta al trattamento farmacologico in modo altamente scalabile.
Caenorhabditis elegans è un modello animale ben consolidato nella ricerca biomedica, largamente impiegata in genomica funzionale e studi di invecchiamento. Per valutare la salute e il benessere degli animali in fase di studio, uno in genere si basa su letture di motilità, quali la misurazione del numero di curve del corpo o la velocità di movimento. Queste misurazioni coinvolgono di solito conteggio manuale, rendendolo difficile da ottenere buona significatività statistica, come tempo e vincoli di lavoro spesso limitare il numero degli animali in ogni esperimento a 25 o meno. Alta potenza statistica, essendo necessaria per ottenere risultati riproducibili e limitare i risultati falsi positivi e negativi quando deboli effetti fenotipici sono studiati, recentemente sono stati compiuti sforzi per sviluppare protocolli automatizzati, incentrate sulla aumentando il sensibilità di rilevazione di motilità e multi-parametrico behavioral profiling. Al fine di estendere il limite di rilevazione al livello necessario per catturare i piccoli cambiamenti fenotipici che spesso sono fondamentali per gli studi genetici e scoperta di nuovi farmaci, descriviamo qui un’evoluzione tecnologica che consente lo studio di singoli fino a 5.000 animali simultaneamente, aumentando la potenza statistica delle misurazioni da circa 1.000 rispetto ai saggi manuale e circa 100 volte rispetto ad altri metodi automatizzati disponibili.
Circa mezzo secolo fa, Sydney Brenner introdotto Caenorhabditis elegans (c. elegans) come un sistema modello per studiare lo sviluppo e la neurobiologia, come questo piccolo (1 mm di lunghezza), vite senza fine del nematode trasparente è facile da manipolare geneticamente modificati e di mantenere nel laboratorio1. Oggi, c. elegans è usato per studiare una vasta gamma di processi biologici, tra cui l’apoptosi, la segnalazione delle cellule, la natura del ciclo cellulare, regolazione genica, metabolismo e invecchiamento2. Inoltre, la complessità cellulare e tessutale, modelli di espressione della proteina e la conservazione dei percorsi di malattia tra c. elegans e organismi superiori (80% dei geni di vite senza fine hanno un ortologo umano), collegata con la semplicità e rapporto costo-efficacia di coltivazione, renderlo un organismo di modello efficace in vivo suscettibili di alto-rendimento genetico3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 e droga proiezioni16 14,15,. Per tutte queste ragioni, c. elegans è stato impiegato per la caratterizzazione delle vie molecolari normale e relazione con la malattia; nel campo della neurodegenerazione, ad esempio, ha permesso l’esplorazione degli effetti dell’invecchiamento sulla proteina aggregazione3,4,7,15,17, 18e la caratterizzazione dei promotori e degli inibitori della proteina aggregazione3,4,5,6,7,14, 18.
La forma fisica generale dei vermi, che è un parametro importante del comportamento per essere definiti in questo tipo di studio, può essere manualmente misurato in una varietà di modi, come ad esempio contando il numero di curve del corpo per minuto (BPM)4,6, 19, o misurando la velocità di movimento20,21,22, come pure misurando la durata della vita media e tassi di paralisi. Sebbene misure manuali di corpo curve e velocità di movimento hanno portato a molti importanti intuizioni una varietà di meccanismi molecolari e meccanismi3,4,14,19, 20,23, analisi manuale rimangono attualmente a bassa velocità di trasmissione, altamente laborioso e che richiede tempo, pur essendo incline agli errori e ai pregiudizi umani. Questi problemi presentano notevoli sfide per la raccolta dei dati con potenza statistica sufficiente a distinguere sottili cambiamenti comportamentali. Questa limitazione è particolarmente rilevante per la droga di screening come trattamenti con farmaci potenziali molecole conducono spesso a piccoli cambiamenti fenotipici24, richiedendo quindi lo studio di un gran numero di animali al fine di acquisire risultati riproducibili. Per illustrare questo punto, recenti studi hanno dimostrato che un alto potere di rilevazione (POD) è necessario definire con fiducia qualsiasi cambiamento significativo nel comportamento e per limitare i risultati falsi positivi25. Ciò ha provocato una forte motivazione della comunità di c. elegans per sostituire il conteggio manuale con misurazioni riproducibili, automatizzato, tempo – e costi – effective. Per soddisfare questa richiesta, diversi laboratori hanno recentemente sviluppato metodi per misurazioni ad alta sensibilità e il verme accurato rilevamento di maggior numero di vermi22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
Al fine di espandere ulteriormente il processo di automazione per le larghe coorti di animali necessari per misurazioni statisticamente significativi, abbiamo recentemente sviluppato un ampio campo di vista nematode monitoraggio piattaforma (WF-NTP)15,34 ,35,36, che consente l’indagine simultanea di più letture fenotipiche sulle popolazioni molto grande verme, un fattore chiave nell’individuazione fenotipica statisticamente rilevanti25. Non solo può il WF-NTP attualmente monitorare fino a 5.000 animali in parallelo, ma le letture fenotipiche includono anche i parametri multipli, compreso il tasso e l’ampiezza delle curve del corpo, la velocità di movimento, la frazione della popolazione che è paralizzata, e la taglia degli animali. Pertanto è facilmente possibile allo schermo migliaia di vermi in parallelo e per combinare le diverse letture in una mappa del comportamento per creare un multidimensionale dell’impronta digitale36. Il software open-source associato è scritto in Python, che è anche necessaria per farlo funzionare ed è completamente personalizzabile. Un’interfaccia utente grafica (GUI) è a disposizione per consentire agli utenti di adottare questa tecnologia.
Qui, presentiamo una serie di protocolli che illustrano alcune delle applicazioni potenziali di WF-NTP. In particolare, discutiamo la somministrazione di composti, che vanno da piccole molecole a terapie proteiche e descrivono come schermo loro effetti direttamente sopra grandi popolazioni di vermi, efficacemente eliminando così la necessità di assaggiare piccole sub-popolazioni. L’utilizzo di WF-NTP per tale scopo già ha portato notevoli vantaggi nelle procedure finalizzate a progettare programmi di scoperta della droga del morbo di Alzheimer (annuncio)15,34,35 e malattia di Parkinson (MDP)18 utilizzando dati in vivo per la valutazione dei candidati terapeutico35,37.
A causa della rapida espansione delle tecniche all’interno del campo di scienze ottiche, è ora possibile affrontare l’esigenza di metodi automatizzati negli studi di c. elegans in modo sostanzialmente nuovo. Di conseguenza, un numero di piattaforme20,41,42,43,44,45,46 di rilevamento digitale sono stati progettati e messi a disposizione sul ultimi anni al fine di sostituire il conteggio manuale dei parametri come la velocità di movimento, piegatura di frequenza, il tasso di paralisi, come pure le forme più complesse di comportamenti quali omega si trasforma e la misurazione di durata della vita. Più recenti piattaforme automatizzate hanno notevolmente migliorato la riproducibilità e sensibilità di c. elegans studi41 e fornito i dati di alta qualità su piccole coorti o anche singoli animali. Abbiamo deciso di estendere l’automazione dell’analisi del comportamento di vite senza fine per renderlo anche possibile valutare i fenotipi delle coorti di migliaia di animali in parallelo. Il vantaggio principale dell’approccio di studiare coorti di worm è che permette per la contabilità per l’elevata variabilità intrinseca del verme comportamento24 e per il fatto che gli studi di trattamento di droga spesso portano a sottili variazioni fenotipiche, che sono difficili da rilevare con sufficiente significatività statistica quando si utilizza un piccolo gruppo di animali. Un alto potere di rilevazione (POD) è infatti necessario per rilevare con fiducia alcuna variazione significativa nel comportamento e per limitare i risultati falsi positivi25.
Qui, abbiamo descritto una serie di protocolli basati su un metodo di screening automatizzato recentemente segnalati per c. elegans, il nematode ampio campo di vista Monitoraggio piattaforma (WF-NTP)36. Il protocollo descritto qui è diviso in 5 parti. Parti 1 e 2 descrivono la preparazione delle popolazioni di grande verme. Fasi critiche sono la sterilità delle condizioni di lavoro e preparazione di reagenti e piatti necessari per eseguire gli esperimenti. Notiamo che, a causa del maggiore throughput fornito dal presente protocollo rispetto ad altre metodologie36di screening, richiede anche una maggiore quantità di reagenti; Questo fattore deve essere considerato con attenzione nel disegno sperimentale. Notiamo anche che il passo d’imbianchimento è fondamentale e deve essere testato in anticipo come un gran numero di uova e larve sane sono necessari per eseguire questi esperimenti. Parte 3 del presente protocollo in dettaglio come consegnare i farmaci in tinta media e schermo verme popolazioni. Notiamo che questa parte del protocollo è fortemente dipenda dal numero di farmaci e concentrazioni di farmaco da testare da parte dell’utente in parallelo. La completa automazione della procedura di screening e acquisizione dati rapido spostare il passaggio limitante dall’osservazione del comportamento di preparazione dei reagenti e la crescita e la sincronizzazione delle popolazioni delle grande verme. I passaggi chiavi durante la proiezione del comportamento sono gli intervalli di tempo di registrazione e qualsiasi verme gestione passaggi (ad esempio, il trasferimento di vermi dalle piastre NGM per la piattaforma di tracking). Il protocollo descritto qui è un esempio progettato per schermare i vermi per fino a 9 giorni durante la durata della vita adulta; Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato a tutti i punti di tempo l’utente desideri, ad esempio, 18 giorni consecutivi36a schermo. Parte 4 viene illustrata l’applicazione del protocollo di fornire molecole proteiche (ad es., anticorpi e chaperoni molecolari) in c. eleganse Mostra come il protocollo illustrato nelle parti 1-3 può essere facilmente personalizzato, a seconda del desiderato applicazione. Dimostriamo come questa procedura può essere estesa non solo alla consegna di droga-come molecole, ma anche per l’amministrazione di chaperoni o anticorpi molecolare37. I primi quattro passaggi (parti) sono effettuati in condizioni sterili, se non diversamente specificato. Tutti i componenti liquidi dovrebbero essere sterilizzati in autoclave prima dell’uso e deve essere eseguita la procedura di incubazione a 70% di umidità relativa. Nella parte 5, descriviamo come utilizzare il pacchetto software fornito in combinazione con la fase di rilevamento. Questo software è stato progettato per l’analisi dei dati di WF-NTP relazionati al comportamento delle popolazioni di grande verme. Suggeriamo che l’utente segue le linee guida fornite in parte 5 per l’analisi dei dati; Tuttavia, questi parametri dipendono le caratteristiche specifiche dei video registrati (cioè, fps, campo di vista, risoluzione video, il numero di fotogrammi acquisiti). La funzione di esempio fornita nella GUI è stata progettata per facilitare la valutazione dei parametri corretti prima dell’analisi.
Queste serie di protocolli consentono di analizzare i fenotipi di grandi popolazioni di c. elegans (attualmente fino a 5.000 singoli vermi in parallelo) in modo efficace, ridurre artefatti a causa della variabilità intrinseca del comportamento degli animali , d’accordo con gli studi preliminari sul potere di rilevamento necessaria per raggiungere il significato statistico per gli studi di c. elegans25. La piattaforma utilizza un sistema di telecamere ad alta risoluzione, in grado di registrare immagini di un gran numero di animali ad alta velocità, registrando contemporaneamente più larghe coorti. Le elevate prestazioni e alta velocità di trasmissione del protocollo NTP WF rende possibile determinare molto piccoli cambiamenti nel comportamento di vite senza fine in maniera molto accurata. Pertanto, questa metodologia consente nuovi approcci vanno considerati non solo per lo studio della biologia di c. elegans, ma inoltre per ricerca medica e farmacologica, come ad esempio lo screening ad alta resa di modificazioni genetiche e droga trattamenti. Questa procedura ha anche il vantaggio di permettere studi di paralisi da eseguire in parallelo con altre misure comportamentali, una caratteristica fondamentale negli studi di screening molecolare.
I risultati finora raggiunti nei programmi di scoperta di droga AD15,34,35 e PD18 dimostrano l’importanza dell’acquisizione dei dati ampio campo di vista sostanzialmente aumentare il numero di animali che possono essere monitorati in un singolo esperimento, con una significativa diminuzione gli errori sperimentali e migliorando notevolmente la validità statistica degli studi. Mentre l’attuale approccio descritto in questo protocollo si è concentrata su come affrontare le sfide nel campo della scoperta di nuovi farmaci, speriamo che la metodologia sarà ampiamente adottata nella Comunità, e che l’applicazione sarà estesa al complesso genetico e studi comportamentali ed espandere il numero di fenotipi che sono attualmente rilevabili.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal centro per malattie Misfolding (CMD). FAA è supportato da un Senior Research Fellowship award dal morbo di Alzheimer Society, UK (Grant numero 317, AS-SF-16-003). I ceppi di c. elegans sono stati ottenuti da Caenorhabditis elegans centro genetico (CGC).
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |