Wir beschreiben Protokolle für die Verwendung der breiten Sichtfeld Nematoden Tracking-Plattform (WF-NTP) ermöglicht hohen Durchsatz phänotypischen Charakterisierung von großen Populationen von Caenorhabditis Elegans. Diese Protokolle können verwendet werden, um subtile Verhaltensänderungen in mutierte Stämme oder in Reaktion auf die pharmakologische Behandlung in einer hochgradig skalierbare Weise zu charakterisieren.
Caenorhabditis Elegans ist ein gut etabliertes Tiermodell in der biomedizinischen Forschung, weit verbreitet in funktionelle Genomik und Alterung Studien eingesetzt. Um die Gesundheit und Fitness der Tiere unter Studie zu beurteilen, setzt man in der Regel auf Motilität anzeigen, wie die Messung von der Anzahl der Körper Kurven oder die Geschwindigkeit der Bewegung. Diese Messungen in der Regel beinhalten manuelle Zählung, macht es schwierig zu erhalten gute statistischen Signifikanz, als Zeit und Arbeit Einschränkungen häufig die Anzahl der Tiere in jedem Experiment auf 25 oder weniger. Da hohe statistische Aussagekraft notwendig ist, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen und falsch positive und negative Ergebnisse zu begrenzen, wenn schwache phänotypische Auswirkungen untersucht werden, vor kurzem wurden Anstrengungen unternommen, zu automatisierten Protokolle konzentrierte sich auf die Steigerung der Empfindlichkeit der Motilität-Erkennung und multiparametrischen Verhaltensstörungen profiling. Zur Erweiterung der Nachweisgrenze auf die Ebene benötigt, um die kleinen phänotypischen Veränderungen zu erfassen, die oft für genetische Studien und Wirkstoffforschung entscheidend sind, beschreiben wir hier eine technologische Entwicklung, die es die Untersuchung von bis zu 5.000 einzelne Tiere ermöglicht Gleichzeitig erhöhen die statistische Aussagekraft der Messungen von ca. 1,000-fold im Vergleich zu manuellen Tests und etwa 100fach im Vergleich zu anderen automatisierten Methoden.
Vor etwa einem halben Jahrhundert Sydney Brenner eingeführt Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) als Modellsystem, Entwicklungs- und Neurobiologie, als dieses kleine zu studieren (1 mm in der Länge), transparente Nematoden Wurm ist leicht zu manipulieren genetisch und im Labor1zu erhalten. Heute wird C. Elegans verwendet, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich der Apoptose, Zelle, die Art des Zellzyklus, Genregulation, Stoffwechsel und Altern2zu studieren. Darüber hinaus die Mobilfunk- und Gewebe Komplexität, Protein Expressionsmuster und die Erhaltung der Krankheit Wege zwischen C. Elegans und höheren Organismen (80 % der Wurm Gene haben einen menschlichen orthologs), verbunden mit der Einfachheit und Wirtschaftlichkeit des Anbaus, machen es effektiv in Vivo Modellorganismus zugänglich Hochdurchsatz-genetische3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 und Medikament14,15,16 -Screenings. Aus all diesen Gründen ist für die Charakterisierung von normalen und krankheitsbezogenen molekulare Signalwege C. Elegans beschäftigt; im Bereich der Neurodegeneration ermöglichte es zum Beispiel die Erforschung der Auswirkungen des Alterns auf Protein Aggregation3,4,7,15,17, 18, und die Charakterisierung von Promotoren und Inhibitoren Protein Aggregation3,4,5,6,7,14, 18.
Die allgemeine Fitness der Würmer, die ein wichtiger verhaltensbezogene Parameter in dieser Art von Studie definiert werden, kann manuell in eine Vielzahl von Möglichkeiten, wie z. B. gemessen werden durch zählen der Anzahl der Körper Kurven pro Minute (BPM)4,6, 19, oder durch Messung der Geschwindigkeit der Bewegung20,21,22, sowie durch Messung der durchschnittlichen Lebensdauer und Preise der Lähmung. Obwohl manuelle Messungen Körper Kurven und Geschwindigkeit der Bewegung zu viele wichtige Einblicke in eine Vielzahl von molekularen Wege und Mechanismen3,4,14,19geführt haben, 20,23, manuelle Tests bleiben derzeit niedrigen Durchsatz, sehr arbeitsintensiv und zeitaufwendig und anfällig für Fehler und auf menschliche Vorurteile. Diese Fragen Herausforderungen erhebliche in der Sammlung von Daten mit ausreichend statistische Aussagekraft, subtile Verhaltensänderungen zu unterscheiden. Diese Einschränkung gilt insbesondere für Drug screening als Behandlungen mit potenziellen Medikament Moleküle führen oft zu kleinen phänotypischen Veränderungen24, daher erfordert die Untersuchung einer großen Anzahl von Tieren um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Um dies zu verdeutlichen, haben jüngste Studien gezeigt, dass eine hohe Leistung der Erkennung (POD), mit Zuversicht signifikanten Änderungen im Verhalten definieren und falsch positive Ergebnisse25beschränken muss. Dies führte zu einer starken Motivation in der Gemeinschaft von C. Elegans , manuelle Zählung mit reproduzierbaren, automatisiert, Zeit – und Kosten – wirtschaftlicheren Messungen zu ersetzen. Um diese Nachfrage zu befriedigen, haben mehrere Labore vor kurzem entwickelt Methoden zur hochempfindlichen Messungen und genaue Wurm Verfolgung der größeren Zahl der Würmer22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
Um den Prozess der Automatisierung weiter zu den großen Kohorten von Tieren für statistisch signifikante Messungen benötigt auszubauen, haben wir vor kurzem ein breites Sichtfeld Nematoden tracking-Plattform (WF-NTP)15,34 entwickelt. ,35,36, ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung der mehrere phänotypische anzeigen auf sehr großen Wurm Bevölkerungen, ein Schlüsselfaktor für statistisch relevante phänotypischen Erkennung25. Nicht nur kann der WF-NTP-Server überwachen derzeit bis zu 5.000 Tiere parallel, sondern die phänotypische anzeigen gehören auch mehrere Parameter, einschließlich die Rate und die Amplitude der Körper Kurven, die Geschwindigkeit der Bewegung, der Anteil der Bevölkerung, die gelähmt ist, und die Größe der Tiere. Es ist daher ohne weiteres möglich, Bildschirm Tausende von Würmern parallel und verbinden die verschiedenen Anzeigen in behavioral Karten erstelle ich eine multidimensionale Fingerabdruck-36. Die zugehörige Open-Source-Software ist in Python geschrieben, das ist auch erforderlich, um es zu betreiben und ist vollständig anpassbar. Eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) ist ebenfalls vorhanden, damit Benutzer diese Technologie übernehmen können.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Protokollen, die einige der möglichen Anwendungen des WF-NTP zu veranschaulichen. Insbesondere wir diskutieren die Verwaltung von Verbindungen, von kleinen Molekülen bis hin zu Proteintherapeutika, und beschreiben Sie, wie ihre Auswirkungen auf den Bildschirm direkt über große Populationen von Würmern, somit effektiv entfernt die Notwendigkeit, kleine Probe Sub-Populationen. Die Verwendung von den WF-NTP-Server für einen solchen Zweck brachte bereits erhebliche Vorteile im Verfahren zur, Drug Discovery-Programme der Alzheimer-Krankheit (AD)15,34,35 und der Parkinson-Krankheit (PD)18 zu entwerfen mit in-vivo-Daten für die Beurteilung der therapeutischen Kandidaten35,37.
Durch die zügige Expansion von Techniken im Bereich der optischen Wissenschaften ist es nun möglich, die Voraussetzung für die automatisierte Methoden in C. Elegans Studien wesentlich neue Wege anzusprechen. Infolgedessen haben eine Reihe von digitalen Plattformen20,41,42,43,44,45,46 tracking entworfen und hergestellt zur Verfügung über den letzten Jahren um manuelle Zählung der Parameter wie Geschwindigkeit der Bewegung, biegen, Frequenz, Lähmung Rate sowie komplexere Formen von Verhaltensweisen wie Omega Wendungen und Lebensdauer Messungen zu ersetzen. Jüngsten automatisierte Plattformen haben sich deutlich verbessert die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit von C. Elegans 41 und hohe Datenqualität auf kleinen Kohorten oder auch einzelne Tiere zur Verfügung gestellt. Wir beschlossen, die Automatisierung der Analyse der Wurm Verhalten machen es auch möglich, die Phänotypen der Kohorten von Tausenden von Tieren parallel zu bewerten zu verlängern. Der wesentliche Vorteil des Ansatzes der Wurm Kohorten zu studieren ist, dass es für die Buchhaltung für die hohe intrinsische Variabilität der Wurm Verhalten24 und die Tatsache, die dass Medikament Behandlungsstudien oft subtilen phänotypische Variationen, führen die schwierig, mit ausreichend statistische Signifikanz zu erkennen, wenn eine kleine Gruppe von Tieren verwenden. Eine hohe Leistung der Erkennung (POD) ist in der Tat notwendig, um mit Zuversicht signifikante Abweichungen im Verhalten erkennen und falsch positive Ergebnisse25begrenzen.
Hier haben wir eine Reihe von Protokollen basierend auf eine kürzlich berichtet automatisierte Screening-Methode für C. Elegans, das breite Sichtfeld Nematoden tracking-Plattform (WF-NTP)36beschrieben. Das hier beschriebene Protokoll gliedert sich in 5 Teile. Teile 1 und 2 beschreiben die Vorbereitung der großen Wurm Populationen. Wichtige Schritte sind die Sterilität der Arbeitsbedingungen und Vorbereitung der Reagenzien und Platten erforderlich, die Experimente auszuführen. Wir stellen fest, dass aufgrund der erhöhten Durchsatz durch dieses Protokoll im Vergleich zu anderen screening-Methoden36zur Verfügung gestellt, es auch erhöhte Mengen an Reagenzien erfordert; dieser Faktor muss sorgfältig in das experimentelle Design berücksichtigt werden. Wir beachten auch, dass die bleichende Schritt ist entscheidend und muss im Voraus als eine große Anzahl von Eiern getestet werden und gesunde Larven notwendig sind, um diese Experimente laufen. Teil 3 dieses Protokoll beschreibt, wie Sie Drogen in festen Medien und Bildschirm Wurm Bevölkerung liefern. Wir stellen fest, dass dieser Teil des Protokolls ist stark abhängig von der Anzahl der Medikamente und Drogen-Konzentrationen durch den Benutzer parallel getestet werden. Die vollständige Automatisierung der Screening-Verfahren und schnelle Datenerfassung den limitierenden Schritt vom Verhaltensbeobachtung Reagenz Vorbereitung und Wachstum und Synchronisation von großen Wurm Populationen verlagern. Die wichtigsten Schritte während der behavioral Vorführung sind die Timings der Aufnahme und jeder Wurm Umgang mit Schritte (z.B. die Übertragung von Würmern aus der NGM-Platten, die Tracking-Plattform). Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel, entworfen, um die Würmer Bildschirm für bis zu 9 Tage während der Erwachsenen Lebensdauer; jedoch kann dieses Protokoll auf dem Bildschirm so viele Zeitpunkte wie der Benutzer, z. B. 18 aufeinander folgenden Tagen36 wünschtleicht angepasst werden. Teil 4 zeigt dann die Anwendung des Protokolls zu Eiweiß-Molekülen (z. B. Antikörper und molekulare Chaperone) liefern in C. Elegansund zeigt, wie das Protokoll in Teile 1 bis 3 dargestellten leicht, je nach gewünschter angepasst werden kann Anwendung. Wir zeigen, wie dieses Verfahren nicht nur auf die Lieferung von Drogen wie Moleküle, sondern auch für die Verwaltung der molekularen Chaperone oder Antikörper37verlängert werden kann. Die ersten vier Schritte (Teile) werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle flüssigen Bestandteile sollte vor Gebrauch autoklaviert und die Inkubationsschritte sollten durchgeführt werden, bei 70 % relativer Luftfeuchtigkeit. In Teil 5 beschreiben wir gewusst wie: verwenden Sie das Software-Paket in Kombination mit der Tracking-Bühne zur Verfügung gestellt. Diese Software wurde entwickelt für die Analyse von WF-NTP Daten in Bezug auf das Verhalten der großen Wurm Populationen. Wir empfehlen, dass der Benutzer die Richtlinien für die Datenanalyse in Teil 5 folgt; Diese Parameter sind jedoch abhängig von den Besonderheiten der aufgenommenen Videos (fps, Blickfeld, video-Auflösung, Anzahl der erworbenen Bilder). Die Beispiel-Funktion zur Verfügung gestellt in der GUI wurde entwickelt, um die Auswertung der richtigen Parameter vor der Analyse zu erleichtern.
Diese Reihe von Protokollen machen es möglich, die Phänotypen der große Populationen von C. Elegans (derzeit bis zu 5.000 einzelne Würmer parallel) agierende reduziert Artefakte aufgrund der inhärenten Variabilität des Verhaltens der Tiere , im Einvernehmen mit Vorstudien auf die Macht der Erkennung notwendig, statistischen Signifikanz für Studien von C. Elegans25zu erreichen. Die Plattform nutzt ein System von hochauflösenden Kameras, die in der Lage, Aufnahmen einer großen Anzahl von Tieren mit hoher Geschwindigkeit, während gleichzeitig aufzeichnen mehrerer große Kohorten. Die hohe Leistung und hohen Durchsatz von WF-NTP-Protokoll macht es möglich, sehr kleine Veränderungen im Verhalten der Wurm in gewissem Sinne sehr genau zu bestimmen. Diese Methode ermöglicht somit, neue Ansätze gelten nicht nur für das Studium der Biologie von C. Elegans, sondern zusätzlich pharmakologische und medizinische Forschung, wie die Hochdurchsatz-Screening von Genveränderungen und Droge Behandlungen. Dieses Verfahren hat auch den Vorteil, dass Lähmung Studien Parallel mit anderen Verhaltensstörungen Messungen, ein wesentliches Merkmal in molekulare Screening-Untersuchungen durchgeführt werden.
Die Ergebnisse, die bislang in Drug Discovery-Programme AD15,34,35 und PD18 erreicht haben zeigen die Bedeutung der breiten Sichtfeld Datenerfassung erheblich steigern die Anzahl der Tiere, die in einem einzigen Experiment, dadurch erheblich verringern die experimentellen Fehler und erheblich verbessert die statistische Validität Studien überwacht werden können. Während der aktuelle Ansatz in diesem Protokoll beschriebenen konzentriert hat, um Herausforderungen im Bereich der Arzneimittelforschung, wir hoffen, dass die Methodik in der Gemeinschaft allgemein angenommen wird und seine Anwendung auf genetische Anlage erweitert werden soll und Verhaltensstudien und erweitern die Anzahl der Phänotypen, die derzeit nachweisbar sind.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Zentrum für Fehlfaltung Krankheiten (CMD) unterstützt. FAA wird unterstützt durch einen Senior Research Fellowship Award von der Alzheimers Gesellschaft, UK (Grant Nummer 317, AS-SF-16-003). C. Elegans Stämme wurden von den Caenorhabditis Elegans genetischen Zentrum (CGC) erhalten.
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |