Les auteurs décrivent des protocoles d’utilisation de la plate-forme de suivi de nématode large champ de vision (WF-NTP), qui permet la caractérisation phénotypique de haut débit de grandes populations de Caenorhabditis elegans. Ces protocoles peuvent être utilisés pour caractériser les subtils changements de comportement chez les souches mutantes ou en réponse à un traitement pharmacologique d’une façon hautement évolutive.
Caenorhabditis elegans est un modèle animal bien établi dans la recherche biomédicale, largement utilisée dans les études de vieillissement et de génomique fonctionnelle. Pour évaluer la santé et l’aptitude des animaux à l’étude, un dépend généralement lectures de motilité, telles que la mesure du nombre de coudes de corps ou la vitesse du mouvement. Ces mesures nécessitent généralement le comptage manuel, rendant difficile d’obtenir la bonne signification statistique, comme du temps et de contraintes de travail souvent limiter le nombre d’animaux dans chaque expérience à 25 ou moins. Haute puissance statistique étant nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles et limiter des résultats faussement positifs et négatifs lorsqu’on étudie les effets phénotypiques faibles, s’est efforcé récemment d’élaborer des protocoles automatisés afin d’accroître la sensibilité de détection de la motilité et le profilage comportemental multi paramétrique. Afin d’étendre la limite de détection pour le niveau nécessaire pour capturer les petits changements phénotypiques qui sont souvent cruciaux dans les études génétiques et la découverte de médicaments, nous décrivons ici un développement technologique qui permet l’étude des individus pouvant atteindre 5 000 en même temps, augmentant la puissance statistique des mesures par environ 1000 par rapport aux déterminations manuelles et environ 100 fois par rapport aux autres méthodes automatisées disponibles.
Environ un demi-siècle, Sydney Brenner a présenté Caenorhabditis elegans (c. elegans) comme un système modèle pour étudier le développement et la neurobiologie, comme ce petit (1 mm de longueur), le ver nématode transparent est facile à manipuler génétiquement et de maintenir dans le laboratoire1. Aujourd’hui, c. elegans est utilisé pour étudier un large éventail de processus biologiques, y compris l’apoptose, la signalisation cellulaire, la nature du cycle cellulaire, régulation génique, métabolisme et de vieillissement2. En outre, la complexité cellulaire et tissulaire, de modèles d’expression de protéine et de la conservation des voies de la maladie entre le c. elegans et des organismes supérieurs (80 % des gènes de ver ont un orthologue humaine), lié à la simplicité et rentabilité de la culture, rendent un organisme efficace in vivo à haut débit génétique3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 et drogue14,15,16 séances. Pour toutes ces raisons, le c. elegans a été employé pour la caractérisation des mécanismes moléculaires normales et liée à la maladie ; dans le domaine de la neurodégénérescence, par exemple, il a permis l’exploration des effets du vieillissement sur l’agrégation des protéines3,4,7,15,17, 18et la caractérisation des promoteurs et inhibiteurs de la protéine agrégation3,4,5,6,7,14, 18.
La condition physique générale vers, qui est un paramètre important comportemental à définir dans ce type d’étude, peut être mesurée manuellement dans une variété de façons, comme en comptant le nombre de coudes du corps par minute (BPM)4,6, 19, ou en mesurant la vitesse de mouvement20,21,22, ainsi qu’en mesurant la durée de vie moyenne et le taux de paralysie. Bien que des mesures manuelles des replis du corps et la vitesse du mouvement ont mené à plusieurs idées importantes dans une variété de voies moléculaires et les mécanismes3,4,14,19, 20,23, manuels dosages restent actuellement bas-débit, très fastidieuse et chronophage tout en étant sujette aux erreurs et aux préjugés humaines. Ces questions présentent des défis considérables dans la collecte de données avec une puissance statistique suffisante pour distinguer les subtils changements de comportement. Cette limitation est particulièrement pertinente pour les drogues dépistage comme traitements avec le médicament potentiel molécules conduisent souvent à des petits changements phénotypiques24, exigeant par conséquent l’étude d’un grand nombre d’animaux afin d’obtenir des résultats reproductibles. Pour illustrer ce point, les études récentes ont montré qu’une forte puissance de détection (POD) est nécessaire pour définir avec confiance tout changement important dans le comportement et de limiter les faux positifs25. Cela a entraîné une forte motivation dans la communauté de c. elegans pour remplacer un comptage manuel avec des mesures reproductibles, automatisé, temps – et rapport coût – entrée. Pour répondre à cette demande, plusieurs laboratoires ont récemment développé des méthodes pour les mesures de haute sensibilité et suivi précis ver du plus grand nombre de vers22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
Afin d’élargir davantage le processus d’automatisation pour les grandes cohortes d’animaux nécessaire pour les mesures significatives, nous avons récemment développé un large champ de vision nématode suivi de plate-forme (WF-NTP)15,34 ,35,36, qui permet à l’enquête simultanée de multiples lectures phénotypiques sur les populations de très grand ver, un facteur clé dans la détection phénotypiques statistiquement pertinents25. Non seulement peut le WF-NTP actuellement surveiller jusqu’à 5 000 animaux en parallèle, mais les lectures phénotypiques comprennent également plusieurs paramètres, y compris le taux et l’amplitude des courbes du corps, la vitesse du mouvement, la fraction de la population qui est paralysée, et la taille des animaux. On peut donc facilement à l’écran des milliers de vers en parallèle et de combiner les différentes lectures dans une carte comportementale pour créer une empreinte multidimensionnelle36. Le logiciel open source associé est écrit en Python, qui est également nécessaire pour le faire fonctionner et est entièrement personnalisable. Une interface utilisateur graphique (GUI) est également fournie pour permettre aux utilisateurs d’adopter cette technologie.
Nous présentons ici une série de protocoles qui illustrent quelques-unes des applications possibles de la WF-NTP. En particulier, nous discutons l’administration de composés, allant de petites molécules de protéines thérapeutiques et décrire comment trier leurs effets directement sur grandes populations de worms, effectivement éliminant ainsi la nécessité de goûter petit certaines sous-populations. L’utilisation de la WF-NTP à cet effet a déjà apporté des avantages significatifs dans les procédures visant à concevoir des programmes de découverte de médicaments de la maladie d’Alzheimer (ma)15,34,35 et maladie de Parkinson (MP)18 à l’aide de données in vivo pour l’évaluation de candidats thérapeutiques35,37.
Etant donné l’expansion rapide des techniques dans le domaine des sciences optiques, il est maintenant possible d’aborder la nécessité de méthodes automatisées dans les études de c. elegans sensiblement différemment. En conséquence, un certain nombre de digital plates-formes20,41,42,43,44,45,46 de suivi ont été conçus et mis à disposition sur ces dernières années afin de remplacer un comptage manuel des paramètres tels que la vitesse du mouvement, flexion, fréquence, taux de paralysie, ainsi que des formes plus complexes de comportements tels qu’omega tour à tour et les mesures de durée de vie. Dernières plates-formes automatisées ont grandement amélioré la reproductibilité et sensibilité de c. elegans études41 et a fourni des données de haute qualité sur petites cohortes ou même des animaux. Nous avons décidé d’étendre l’automatisation de l’analyse du comportement de ver à permettent également d’évaluer les phénotypes des cohortes de milliers d’animaux en parallèle. Le principal avantage de l’approche de l’étude de cohortes de ver, c’est qu’il permet pour la comptabilité de la forte variabilité intrinsèque de ver comportement24 et pour le fait que les études sur les traitements médicamenteux conduisent souvent à des subtiles variations phénotypiques, qui sont difficiles à détecter avec une signification statistique suffisante lors de l’utilisation d’un petit groupe d’animaux. Une forte puissance de détection (POD) est en effet nécessaire pour détecter avec certitude toute variation importante dans le comportement et de limiter les faux positifs25.
Ici, nous avons décrit une série de protocoles basés sur une méthode de dépistage automatisé récemment déclarés pour c. elegans, le large champ de vision de nématode suivi de plate-forme (WF-NTP)36. Le protocole décrit ici est divisé en 5 parties. Les parties 1 et 2 décrivent la préparation des populations de grand ver. Étapes critiques sont la stérilité des conditions de travail et la préparation des réactifs et des plaques nécessaires pour exécuter les expériences. Nous notons que, en raison de l’un débit plus élevé prévu par le présent protocole par rapport aux autres méthodes36de dépistage, il exige aussi une augmentation des quantités de réactifs ; ce facteur doit être examinée avec soin dans la conception expérimentale. Notons aussi que l’étape de blanchiment est essentielle et doit être testé à l’avance comme un grand nombre de œufs et les larves saines sont nécessaires à l’exécution de ces expériences. Partie 3 du présent protocole détaille comment libérer des médicaments solides ver médias et écran des populations. Nous notons que cette partie du protocole est fortement dépendante du nombre de médicaments et les concentrations de médicament à tester par l’utilisateur en parallèle. L’automatisation complète de la procédure d’examen préalable et d’acquisition de données rapide passer l’étape d’observation comportementale à la préparation des réactifs et de croissance et de synchronisation des populations de grand ver. Les étapes clés lors de la projection comportementale sont les timings de l’enregistrement et à n’importe quel ver manutention étapes (par exemple, le transfert vers des plaques NGM à la plate-forme de suivi). Le protocole décrit ici est un exemple conçu pour détecter les vers pendant 9 jours au cours de la durée de vie adulte ; Toutefois, le présent protocole peut être facilement adapté à l’écran autant de points que l’utilisateur désire, par exemple, 18 jours consécutifs36fois. Partie 4 illustre ensuite l’application du protocole de livrer des molécules de protéines (p. ex., les anticorps et les chaperons moléculaires) dans c. eleganset montre comment le protocole illustré dans les parties 1 à 3 peut être facilement personnalisé, selon la direction désirée demande. Nous montrons comment cette procédure peut être étendue non seulement à la livraison de drogue-comme des molécules, mais aussi pour l’administration d’ anticorps ou chaperons moléculaires37. Les quatre premières étapes (pièces) sont réalisées dans des conditions stériles, sauf indication contraire. Tous les composants liquides doivent être autoclavés avant l’utilisation et les étapes d’incubation doivent être effectuées à 70 % d’humidité relative. Dans la partie 5, nous expliquent comment utiliser le progiciel en combinaison avec la phase de suivi. Ce logiciel a été personnalisé conçu pour l’analyse des données de WF-NTP concernant le comportement des populations de grand ver. Nous suggérons que l’utilisateur suit les directives fournies dans la partie 5 pour l’analyse des données ; Cependant, ces paramètres dépendent des caractéristiques spécifiques des vidéos enregistrées (fps, champ de vision, résolution vidéo, nombre d’images acquises). L’exemple de fonction fourni dans l’interface graphique a été conçu pour faciliter l’évaluation des paramètres corrects avant l’analyse.
Ces séries de protocoles permettent d’analyser les phénotypes de grandes populations de c. elegans (actuellement jusqu’à 5 000 vers individuels en parallèle) efficacement, réduction des artéfacts en raison de la variabilité intrinsèque du comportement des animaux , en accord avec les études préliminaires sur la puissance de détection nécessaire pour atteindre la signification statistique des études de c. elegans,25. La plateforme utilise un système de caméras haute résolution, capables d’enregistrer des images d’un grand nombre d’animaux à grande vitesse, tout en enregistrant simultanément plusieurs grandes cohortes. La haute performance et un débit élevé du protocole NTP-WF permet de déterminer très petits changements dans le comportement de ver de manière très précise. Par conséquent, cette méthodologie permet de nouvelles approches à prendre en considération non seulement pour l’étude de la biologie de c. elegans, mais en plus pour des recherches pharmacologiques et médicales, telles que le criblage à haut débit de modifications génétiques et de la drogue traitements. Cette procédure a également l’avantage de permettre des études de paralysie à exécuter en parallèle avec les autres mesures comportementales, un élément clé dans les études de dépistage moléculaire.
Les résultats obtenus jusqu’à présent dans les programmes de découverte de drogue de AD15,34,35 et PD18 démontrent l’importance de d’acquisition de données large champ de vision en augmentant sensiblement le nombre d’animaux pouvant être analysés en une seule expérience, diminuant ainsi considérablement les erreurs expérimentales et améliorant considérablement la validité statistique des études. Alors que l’approche actuelle décrite dans le présent protocole a porté sur les défis dans le domaine de découverte de médicaments, nous espérons que la méthodologie sera largement adoptée dans la Communauté, et que son application sera étendue à la génétique complexe et des études comportementales et augmenter le nombre de phénotypes actuellement détectables.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Centre pour la mauvais repliement des maladies (CMD). FAA est pris en charge par un Senior Research Fellowship award de l’Alzheimer Society, UK (Grant nombre 317, AS-SF-16-003). Les souches de c. elegans ont été prélevés le Caenorhabditis elegans Centre génétique (CGC).
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |