يصف لنا البروتوكولات لاستخدام منصة واسعة المجال لعرض تتبع السلكية (WF-NTP)، الذي يتيح لتوصيف عدد كبير من السكان من ايليجانس كاينورهابديتيسالمظهرية الفائق. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لوصف التغييرات السلوكية خفية في سلالات متحولة أو استجابة للعلاج الدوائي بصورة تدرجية عالية.
ايليجانس كاينورهابديتيس نموذج حيوان راسخة في مجال البحوث الطبية الحيوية، تستخدم على نطاق واسع في دراسات الشيخوخة وعلم الجينوم الوظيفي. لتقييم الصحة واللياقة البدنية من الحيوانات تحت الدراسة، واحد يعتمد عادة على قراءات حركية، مثل قياس عدد الانحناءات الجسم أو سرعة الحركة. وعادة ما تنطوي هذه القياسات العد اليدوي، مما يجعل صعوبة في الحصول على دلالة إحصائية جيدة، كالوقت والعمل القيود غالباً ما تحد من عدد الحيوانات في كل تجربة إلى 25 أو أقل. منذ عالية القدرة الإحصائية اللازمة الحصول على النتائج استنساخه والحد من النتائج الإيجابية والسلبية الكاذبة عند التحقيق في تأثيرات المظهرية ضعيفة، بذلت جهود مؤخرا وضع بروتوكولات الآلي التي ركزت على زيادة حساسية للكشف عن حركية والتنميط السلوكي متعدد حدودي. بغية تمديد المهلة للكشف إلى المستوى اللازم لالتقاط التغييرات المظهرية الصغيرة التي غالباً ما تكون حاسمة في الدراسات الوراثية واكتشاف الأدوية، يصف لنا هنا تنمية تكنولوجية التي تمكن من دراسة الحيوانات الفردية يصل إلى 5,000 في نفس الوقت، زيادة القوة الإحصائية للقياسات بحوالي 1,000-fold مقارنة مع الاختبارات اليدوية وحوالي معززات مقارنة بالأساليب الأخرى الآلي المتاحة.
حوالي نصف قرن، قدم سيدني برينر ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كنظام نموذجي لدراسة التنمية وعلم الأعصاب، كهذا صغير (1 مم في الطول)، الدودة السلكية شفافة من السهل التلاعب وراثيا والاستمرار في مختبر1. اليوم، يتم استخدام C. ايليجانس لدراسة طائفة واسعة من العمليات البيولوجية بما في ذلك المبرمج، مما يشير إلى خلية، وطبيعة دورة الخلية، تنظيم الجينات، والايض، والشيخوخة2. وعلاوة على ذلك، تعقد الخلايا والأنسجة، أنماط التعبير البروتين والمحافظة على مسارات المرض بين C. ايليجانس والكائنات أعلى (80% جينات الفيروس المتنقل قد أورثولوجوي بشرية)، ترتبط بالبساطة و الفعالية من حيث التكلفة لزراعة وجعله كائن نموذج فعال في فيفو قابلة للفائق الوراثية3،،من45،، ،من67 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 والمخدرات عروض14،،من1516 . ولجميع هذه الأسباب، C. ايليجانس قد استخدمت لتوصيف المسارات الجزيئية العادية وذات الصلة بالمرض؛ في ميدان نيوروديجينيريشن، على سبيل المثال، قد مكن استكشاف آثار الشيخوخة على البروتين تجميع3،،من47،،من1517، 18، والتوصيف للمروجين ومثبطات البروتين تجميع3،،من45،،من67،14، 18.
اللياقة البدنية عموما من الديدان، ومعلمة سلوكية هامة لتعريف بهذا النوع من الدراسة، يمكن أن تقاس يدوياً في مجموعة متنوعة من الطرق، كما هو الحال بإحصاء عدد الانحناءات الهيئة الواحدة والدقيقة (BPM)4،6، 19، أو عن طريق قياس سرعة حركة20،،من21إلى22، وكذلك عن طريق قياس معدلات الشلل ومتوسط عمر. على الرغم من أن القياسات اليدوية من الانحناءات الجسم وسرعة الحركة وأدت إلى العديد من الأفكار الهامة في مجموعة متنوعة من المسارات الجزيئية والآليات3،4،،من1419، 20،23، الاختبارات اليدوي تظل منخفضة الإنتاجية حاليا وتتطلب عمالة مكثفة جداً وتستغرق وقتاً طويلاً حين يجري عرضه للأخطاء والتحيزات البشرية. هذه المسائل تحديات كبيرة في جمع البيانات مع قوة إحصائية كافية للتمييز بين التغيرات السلوكية خفية. هذا القيد ذات الصلة لا سيما للمخدرات الفحص كعلاجات مع المخدرات المحتملين الجزيئات التي غالباً ما تؤدي إلى التغيرات المظهرية الصغيرة24، ولذلك تتطلب دراسة عدد كبير من الحيوانات من أجل الحصول على النتائج استنساخه. ولتوضيح هذه النقطة، وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن قوة عالية للكشف عن (جراب) أمر ضروري لتحديد أية تغييرات هامة بالثقة في السلوك والحد من النتائج الإيجابية الكاذبة25. وقد أسفر هذا حافزا قويا في المجتمع C. ايليجانس ليحل محل العد اليدوي مع قياسات استنساخه، الآلي، وقت–وفعالة من حيث التكلفة. ولتلبية هذا الطلب، وضعت عدة مختبرات مؤخرا إلى أساليب لقياسات عالية الحساسية وتتبع دودة دقيقة لعدد أكبر من الديدان22،،من2627،28 ،،من2930،31،،من3233.
من أجل زيادة توسيع عملية التشغيل الآلي لافواج كبيرة من الحيوانات اللازمة لقياسات يعتد به إحصائيا، وقد وضعنا مؤخرا ديدان أسطوانية واسعة المجال لعرض تتبع منهاج (WF-NTP)15،34 ،،من3536، الذي يتيح التحقيق متزامنة متعددة قراءات المظهرية على السكان دودة كبيرة جداً، وعاملا رئيسيا في الكشف عن الشكلية إحصائيا ذات الصلة25. WF-NTP حاليا مراقبة الحيوانات تصل إلى 5,000 جنبا إلى جنب، بل قراءات المظهرية أيضا تضمين معلمات متعددة، بما في ذلك معدل والسعة الانحناءات الجسم، وسرعة الحركة، وجزء صغير من السكان التي هي بالشلل، حجم الحيوانات. ولذلك من الممكن سهولة الشاشة آلاف من الديدان بالتوازي، والجمع بين قراءات مختلفة في خارطة سلوكية لخلق بصمات الأصابع متعددة الأبعاد36. البرمجيات المفتوحة المصدر المرتبطة بها هو مكتوب في بيثون، مطلوب أيضا لتشغيله، وهو تماما للتخصيص. كما تتوفر واجهة مستخدم رسومية (GUI) لتمكين المستخدمين من اعتماد هذه التكنولوجيا.
وهنا، نقدم سلسلة من البروتوكولات التي توضح بعض التطبيقات المحتملة ل WF-معاهدة عدم الانتشار. على وجه الخصوص، نحن مناقشة إدارة المركبات، بدءاً من الجزيئات الصغيرة للمداواة البروتين، وتصف كيفية فحص آثارها مباشرة عبر عدد كبير من السكان من الديدان، وبالتالي فعالية إزالة الحاجة إلى أخذ عينة صغيرة السكان الفرعية. استخدام WF-معاهدة عدم الانتشار لهذا غرض قد حققت بالفعل مزايا كبيرة في إجراءات تهدف إلى تصميم برامج اكتشاف المخدرات مرض الزهايمر (AD)15،،من3435 ومرض باركنسون (PD)18 باستخدام البيانات الحية في تقييم المرشحين العلاجية35،37.
بسبب التوسع السريع في تقنيات داخل ميدان العلوم البصرية، من الممكن الآن لمعالجة الحاجة إلى أساليب مؤتمتة في دراسات C. ايليجانس بطرق جديدة إلى حد كبير. كنتيجة لذلك، تم تصميم عدد الرقمية تتبع منصات20،،من4142،43،44،،من4546 وإتاحتها عبر السنوات القليلة الماضية من أجل استبدال العد اليدوي للمعلمات مثل سرعة الحركة، الانحناء التردد، ومعدل الشلل، فضلا عن أشكال أكثر تعقيداً من السلوكيات مثل يتحول أوميغا، وقياسات عمر. أحدث المنصات المؤتمتة تحسنت إلى حد كبير في إمكانية تكرار نتائج ودراسات41 حساسية ايليجانس جيم- وقدمت بيانات عالية الجودة في مجموعات صغيرة أو حتى كل من الحيوانات. قررنا تمديد التشغيل الآلي لتحليل سلوك دودة تجعل من الممكن تقييم تعمل الأفواج الآلاف من الحيوانات في نفس الوقت أيضا. والميزة الرئيسية للنهج المتبع في دراسة الأفواج دودة هو أنه يتيح للمحاسبة لتباين جوهري عالية دودة السلوك24 ولكون دراسات علاج المخدرات غالباً ما تؤدي إلى الاختلافات المظهرية خفية، من الصعب الكشف عن مع دلالة إحصائية كافية عند استخدام مجموعة صغيرة من الحيوانات. قوة عالية للكشف عن (جراب) في الواقع ضرورية للكشف عن أي اختلاف كبير في السلوك مع الثقة والحد من النتائج الإيجابية الكاذبة25.
وهنا، لقد قمنا بوصف سلسلة من البروتوكولات القائمة على أسلوب فرز الآلي المبلغ عنها مؤخرا C. ايليجانس، ديدان أسطوانية واسعة المجال لعرض تتبع منهاج (WF-NTP)36. البروتوكول هو موضح هنا ينقسم إلى 5 أجزاء. تصف الأجزاء 1 و 2 إعداد السكان الكبيرة دودة. الخطوات الحاسمة هي عقم ظروف العمل وإعداد الكواشف والصفائح اللازمة لتشغيل هذه التجارب. ونلاحظ أنه بسبب زيادة الإنتاجية المقدمة بموجب هذا البروتوكول مقارنة بغيرها فحص المنهجيات36، كما يتطلب كميات متزايدة من المواد الكاشفة؛ وهذا العامل يحتاج إلى النظر بعناية في التصميم التجريبي. ونلاحظ أيضا أن الخطوة تبيض أمر بالغ الأهمية، ويحتاج إلى اختبار مقدما كعدد كبير من البيض واليرقات صحية ضرورية لتشغيل هذه التجارب. الجزء 3 من هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تسليم المخدرات في دودة وسائط الإعلام والشاشة الصلبة السكان. ونلاحظ أن هذا الجزء من البروتوكول تعتمد اعتماداً شديدا على العدد من العقاقير والمخدرات تركيزات يمكن اختباره بواسطة المستخدم في نفس الوقت. أتمتة كاملة لإجراء الفحص والحصول على البيانات بسرعة التحول خطوة تحد من المراقبة السلوكية لإعداد كاشف والنمو والمزامنة من السكان دودة كبيرة. الخطوات الرئيسية أثناء فحص السلوكية هي أوقات التسجيل وأي دودة التعامل مع الخطوات (مثلاً، نقل الديدان من لوحات NGM إلى منصة التعقب). البروتوكول الموصوفة هنا مثال مصممة للشاشة الديدان لمدة 9 أيام خلال عمر الكبار؛ ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة الشاشة العديد من النقاط الزمنية حسب رغبة المستخدم، مثلاً، 18 يوما على التوالي36. ويوضح الجزء 4 ثم تطبيق البروتوكول على تسليم الجزيئات البروتينية (مثل الأجسام المضادة ومرافقين الجزيئية) إلى C. ايليجانس، ويظهر كيف البروتوكول يتضح في الأجزاء 1-3 يمكن تخصيصها بسهولة، حسب المطلوب التطبيق. علينا أن نظهر كيف يمكن تمديد هذا الإجراء ليس فقط لإيصال جزيئات شبيهة بالمخدرات ولكن أيضا لإدارة مرافقين أو الأجسام المضادة الجزيئية37. تنفذ الخطوات الأربعة الأولى (أجزاء) تحت ظروف معقمة، إلا إذا ذكر خلاف ذلك. يجب أن تكون كافة المكونات السائلة يعقم قبل الاستخدام وحضانة الخطوات التي ينبغي أن تجري في الرطوبة النسبية 70%. في الجزء 5، ونحن تصف كيفية استخدام حزمة البرامج المقدمة في تركيبة مع المرحلة التي تعقب. وكان هذا البرنامج مخصصة مصممة لتحليل البيانات WF NTP تتصل بسلوك السكان دودة كبيرة. ونحن نقترح أن المستخدم يتبع المبادئ التوجيهية الواردة في الباب 5 لتحليل البيانات؛ ومع ذلك، هذه المعلمات التي تعتمد على السمات المحددة لأشرطة الفيديو المسجلة (أي في الثانية، ومجال الرؤية، دقة الفيديو، عدد الإطارات المكتسبة). قد تم تصميم الدالة الأمثلة المقدمة في واجهة المستخدم الرسومية تسهيل تقييم المعلمات الصحيحة قبل التحليل.
هذه السلسلة من البروتوكولات تجعل من الممكن لتحليل تعمل لإعداد كبيرة من السكان من C. ايليجانس (حاليا ما يصل إلى 5,000 الديدان الفردية بالتوازي) فعالية، الحد من المصنوعات اليدوية بسبب تباين جوهري في سلوك الحيوانات ، باﻻتفاق مع دراسات تمهيدية بشأن قوة الكشف ضروريا لتحقيق الدلالة الإحصائية للدراسات ايليجانس جيم-25. ويستخدم المنصة نظام الكاميرات ذات الدقة العالية، قادرة على تسجيل الصور لإعداد كبيرة من الحيوانات بسرعة عالية، أثناء تسجيل أفواج كبيرة متعددة في وقت واحد. عالية الأداء والإنتاجية العالية لبروتوكول WF NTP يجعل من الممكن تحديد تغييرات صغيرة جداً في سلوك دودة بطريقة دقيقة جداً. ولذلك، تمكن هذه المنهجية النهج الجديدة التي سينظر فيها لدراسة بيولوجيا C. ايليجانس، بل بالإضافة إلى ذلك للبحوث الطبية والدوائية، مثل الفرز الفائق من التعديلات الوراثية والمخدرات العلاجات. ويمتاز هذا الإجراء أيضا السماح للدراسات الشلل يجب القيام بها بالتوازي مع قياسات سلوكية أخرى، سمة رئيسية في دراسات الفحص الجزيئي.
النتائج التي تحققت حتى الآن في برامج اكتشاف المخدرات الإعلانية15،،من3435 و PD18 تبرهن على أهمية اكتساب واسعة المجال لعرض البيانات في زيادة كبيرة عدد الحيوانات التي يمكن رصدها في تجربة واحدة، إلى حد كبير وبالتالي تقليل الأخطاء التجريبية وإلى حد كبير تحسين صحة الدراسات الإحصائية. بينما ركز النهج الحالية المبينة في هذا البروتوكول على التصدي للتحديات في مجال اكتشاف الأدوية، ونأمل أن المنهجية التي ستعتمد على نطاق واسع في المجتمع، وأن تطبيقه سوف تمتد إلى المجمع الوراثي و الدراسات السلوكية وتوسيع عدد تعمل حاليا لإزالتها.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل المركز ل Misfolding الأمراض (CMD). ويدعم القوات المسلحة اﻷنغولية بمنح “زمالة للبحث أقدم” من المجتمع، المملكة المتحدة مرض الزهايمر (منحة رقم 317، AS-سادس-16-003). وتم الحصول على سلالات C. ايليجانس من ايليجانس كاينورهابديتيس مركز الوراثية (كجك).
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |