We beschrijven de protocollen voor het gebruik van het brede veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), waarmee de fenotypische karakterisering van de high-throughput van grote populaties van Caenorhabditis elegans. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor subtiele gedragsveranderingen in gemuteerde stammen of in reactie op farmacologische behandeling in een uiterst schaalbaar mode karakteriseren.
Caenorhabditis elegans is een gevestigde diermodel in biomedisch onderzoek, algemeen werkzaam in functionele genomica en vergrijzing studies. Om te beoordelen de gezondheid en de conditie van de dieren onder studie, een typisch is afhankelijk van de motiliteit uitlezingen, zoals het meten van het aantal bochten van het lichaam of de snelheid van de beweging. Deze metingen meestal sprake van handmatige tellen, waardoor het uitdagend te verkrijgen van goede statistische significantie, als tijd en arbeid beperkingen vaak Beperk het aantal dieren in elk experiment tot en met 25 of minder. Omdat hoge statistisch onderscheidingsvermogen noodzakelijk is om reproduceerbare resultaten te verkrijgen en valse positieve en negatieve resultaten beperken wanneer zwakke fenotypische effecten onderzocht, er onlangs inspanningen zijn verricht om geautomatiseerde protocollen gericht op het vergroten van de gevoeligheid van de motiliteit detectie en multi parametrische gedrags profiling. Oog op de uitbreiding van de limiet van detectie tot het niveau moesten vangen de kleine fenotypische veranderingen die zijn vaak van cruciaal belang in de genetische studies en Geneesmiddelenontwikkeling, beschrijven we hier een technologische ontwikkeling die het mogelijk de studie van maximaal 5.000 individuele dieren maakt gelijktijdig, verhoging van de statistische power van de metingen door ongeveer 1,000-fold in vergelijking met manuele testen en ongeveer 100-fold in vergelijking met andere beschikbare geautomatiseerde methoden.
Ongeveer een halve eeuw geleden, Sydney Brenner geïntroduceerd Caenorhabditis elegans (C. elegans) als een modelsysteem om ontwikkeling en neurobiologie, als dit kleine studie (1 mm in lengte), transparante nematode worm is gemakkelijk te manipuleren genetisch en in het laboratorium1te handhaven. Vandaag, wordt C. elegans gebruikt voor het bestuderen van een breed scala aan biologische processen zoals apoptosis, cel signalering, de aard van de celcyclus, genregulatie, metabolisme en vergrijzing2. Bovendien, de mobiele en weefsel complexiteit, eiwit-expressiepatronen en het behoud van ziekte trajecten tussen C. elegans en hogere organismen (80% van de worm genen hebben een menselijke orthologue), gekoppeld aan de eenvoud en kosteneffectiviteit van de teelt, maken het een modelorganisme effectieve in-vivo vatbaar voor high-throughput genetische3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 en drug14,15,16 screenings. Om al deze redenen, is C. elegans werkzaam voor de karakterisatie van normale en ziekte verband houdende moleculaire trajecten; op het gebied van neurodegeneratie, bijvoorbeeld, heeft het de exploratie van de gevolgen van de vergrijzing op eiwit aggregatie3,4,7,15,17, 18, en de karakterisatie van de initiatiefnemers en remmers van eiwit aggregatie3,4,5,6,7,14, 18.
De algemene geschiktheid van de wormen, die een belangrijke gedrags parameter in te stellen in dit type van studie, kan worden gemeten handmatig in een verscheidenheid van manieren, zoals door het tellen van het aantal lichaam bochten per minuut (hsm)4,6, 19, of door het meten van de snelheid van beweging20,21,22, alsook door het meten van de gemiddelde levensduur en de tarieven van verlamming. Hoewel handmatige metingen van lichaam bochten en snelheid van de beweging hebben geleid tot vele belangrijke inzichten in een verscheidenheid van moleculaire pathways en mechanismen3,4,14,19, 20,23, manuele testen blijven momenteel laag-doorvoer, zeer arbeidsintensief en tijdrovende terwijl u gevoelig voor fouten en menselijke biases. Deze vraagstukken vormen grote uitdagingen in het verzamelen van gegevens met voldoende statistisch onderscheidingsvermogen te onderscheiden van de subtiele gedragsveranderingen. Deze beperking is met name relevant voor drug screening als behandelingen met potentiële drug moleculen vaak tot kleine fenotypische wijzigingen24 leiden, dus die de studie van grote aantallen dieren om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Ter illustratie van dit punt, de recente studies hebben aangetoond dat een hoge macht van detectie (POD) noodzakelijk om te definiëren met vertrouwen belangrijke wijzigingen in gedrag en is aan het beperken van vals-positieve resultaten25. Dit heeft geresulteerd in een sterke motivatie in de Gemeenschap van C. elegans om het vervangen van de manuele tellen met reproduceerbaar, geautomatiseerde, tijd – en goedkoop – cost-effective metingen. Om te voldoen aan deze eis, hebben verschillende laboratoria onlangs methoden ontwikkeld voor het hoog-gevoeligheids metingen en nauwkeurige worm tracking van groter aantal wormen22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
Om uit te breiden verder het proces van automatisering aan de grote cohorten van dieren nodig voor statistisch significant metingen, hebben we onlangs ontwikkeld een breed veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)15,34 ,35,,36, waarmee het gelijktijdige onderzoek van meerdere fenotypische uitlezingen op zeer grote worm populaties, een belangrijke factor statistisch relevant phenotypical detectie25. Niet alleen de WF-NTP momenteel Activiteitenweergave geeft maximaal 5.000 dieren in parallel, maar de fenotypische uitlezingen ook meerdere parameters, met inbegrip van het tarief en de amplitude van lichaam bochten, de snelheid van de beweging, de Fractie van de bevolking dat is verlamd, en de grootte van de dieren. Het is daarom gemakkelijk mogelijk aan scherm duizenden van wormen in parallel en de verschillende uitlezingen combineren in een gedrags kaart maken van een multidimensionale vingerafdruk36. De bijbehorende open-source software is geschreven in Python, die is ook nodig om hem te bedienen en is volledig aanpasbaar. Een grafische gebruikersinterface (GUI) is ook beschikbaar zodat gebruikers kunnen nemen van deze technologie.
Hier presenteren we een aantal protocollen die enkele van de mogelijke toepassingen van de WF-NTP illustreren. In het bijzonder, we bespreken de administratie van stoffen, variërend van kleine moleculen aan eiwit therapeutiek, en wordt beschreven hoe om hun effecten te sluiten direct boven grote populaties van wormen, dus effectief verwijderen van de noodzaak om te genieten van kleine subpopulatie. Het gebruik van de WF-NTP daartoe een heeft reeds geleid tot aanzienlijke voordelen in procedures die zijn gericht op het ontwerpen van de drug discovery-programma’s van de ziekte van Alzheimer (AD)15,34,35 en de ziekte van Parkinson (PD)18 met behulp van in-vivo-gegevens voor de beoordeling van de therapeutische kandidaten35,37.
Vanwege de snelle expansie van de technieken op het gebied van optische wetenschappen is het nu mogelijk inspelen op de behoefte van de geautomatiseerde methoden in C. elegans studies in aanzienlijk nieuwe manieren. Dientengevolge, een aantal digitale platformen20,41,42,43,44,45,46 bijhouden zijn ontworpen en gemaakt beschikbaar zijn via de laatste jaren ter vervanging van de handmatige tellen van parameters zoals de snelheid van de beweging, frequentie, verlamming tarief, evenals de meer complexe vormen van gedrag zoals omega bochten en levensduur metingen buigen. Meest recente geautomatiseerde platformen hebben sterk verbeterd de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van C. elegans bestudeert41 en hoogwaardige gegevens verstrekt op kleine cohorten of zelfs individuele dieren. We besloten te verlengen van de automatisering van de analyse van het gedrag van de worm te maken het ook mogelijk om te evalueren van de fenotypen van cohorten van duizenden dieren in parallel. Het belangrijkste voordeel van de aanpak van het bestuderen van de worm cohorten is dat het mogelijk maakt voor de boekhouding voor de hoge intrinsieke variabiliteit van worm gedrag24 en voor het feit dat de drug behandeling studies vaak leiden tot subtiele fenotypische afwijkingen, die zijn moeilijk op te sporen met voldoende statistische significantie, bij het gebruik van een kleine groep dieren. Een high power van detectie (POD) is inderdaad noodzakelijk te detecteren met vertrouwen belangrijke afwijkingen in gedrag en te beperken van vals-positieve resultaten25.
Hier hebben we een reeks protocols op basis van een onlangs gerapporteerde geautomatiseerde screeningmethode voor C. elegans, het brede veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)36beschreven. Het protocol hier beschreven is verdeeld in 5 delen. Delen 1 en 2 beschrijven de voorbereiding van grote worm populaties. Er zijn kritische stappen de steriliteit van de arbeidsomstandigheden en de bereiding van reagentia en platen nodig om uit te voeren van de experimenten. Wij stellen vast dat, als gevolg van de grotere gegevensdoorvoer geboden door dit protocol in vergelijking met andere methoden36screening, het vereist ook grotere hoeveelheden van reagentia; deze factor moet zorgvuldig worden overwogen in de proefopzet. We constateren ook dat de bleken stap is van cruciaal belang en moet vooraf worden getest als een groot aantal eieren en gezonde larven noodzakelijk zijn voor stormloop van deze experimenten. Deel 3 van dit protocol detailleert hoe te leveren van geneesmiddelen in vaste media en scherm worm populaties. Wij stellen vast dat dit deel van het protocol is sterk afhankelijk van het aantal drugs en drug concentraties worden getest door de gebruiker in parallel. De volledige automatisering van de screeningprocedure en de snelle data-acquisitie verschuiven de beperkende stap uit gedrags observatie naar reagens voorbereiding, de groei en de synchronisatie van grote worm populaties. De belangrijkste stappen tijdens de gedrags screening zijn de tijden van de opname en elk worm behandeling stappen (bijvoorbeeld, de overdracht van wormen uit de NGM platen aan het platform van de tracking). Het protocol beschreven hier is een voorbeeld dat is ontworpen om het scherm van de wormen voor tot 9 dagen tijdens de levensduur van volwassen; Dit protocol kan echter gemakkelijk aangepast aan scherm zoveel tijd punten als de gebruiker, bijvoorbeeld 18 opeenvolgende dagen36 wenst. Deel 4 illustreert de toepassing van het protocol op het leveren van eiwitmolecules (bijv. antistoffen en moleculaire chaperones) vervolgens in C. elegans, en toont hoe het protocol geïllustreerd in de onderdelen 1-3 kan gemakkelijk worden aangepast, afhankelijk van de gewenste toepassing. We laten zien hoe deze procedure kan worden uitgebreid, niet alleen voor de levering van drugs-achtige moleculen, maar ook voor het beheer van moleculaire chaperones of antilichamen37. De eerste vier stappen (delen) worden uitgevoerd onder steriele condities, tenzij anders vermeld. Alle liquide componenten moet gesteriliseerde met autoclaaf voorafgaand aan het gebruik en de incubatie stappen moeten worden uitgevoerd op 70% relatieve vochtigheid. In deel 5 beschrijven we het gebruik van de softwarepakket geboden in combinatie met de tracking-fase. Deze software heeft geweest aangepaste ontworpen voor de analyse van WF-NTP gegevens met betrekking tot het gedrag van grote worm populaties. Wij stellen voor dat de gebruiker de richtsnoeren die voorzien in deel 5 de data-analyse volgt; deze parameters zijn echter afhankelijk van de specifieke kenmerken van de opgenomen video’s (dat wil zeggen, fps, gezichtsveld, videoresolutie, aantal verworven frames). De voorbeeldfunctie geboden in de GUI is ontworpen om de evaluatie van de juiste parameters voor de analyse.
Deze serie van protocollen maken het mogelijk voor het analyseren van de fenotypen van grote populaties van C. elegans (momenteel maximaal 5.000 individuele wormen parallel) effectief, vermindering van de artefacten als gevolg van de intrinsieke variabiliteit van het gedrag van de dieren , in overleg met de voorbereidende studies op de kracht van detectie nodig is om de statistische significantie voor studies van C. elegans25. Het platform maakt gebruik van een systeem van hoge resolutie camera’s, geschikt voor het opnemen van beelden van grote aantallen dieren op een hoge snelheid, terwijl het gelijktijdig opnemen van meerdere grote cohorten. De hoge prestaties en een hoge doorvoersnelheid van het WF-NTP protocol maakt het mogelijk om zeer kleine veranderingen in gedrag van de worm in een zeer nauwkeurige manier. Daarom maakt deze methodologie nieuwe benaderingen te worden beschouwd, niet alleen voor de studie van de biologie van C. elegans, maar bovendien voor farmacologische en medisch onderzoek, zoals de high-throughput screening van genetische wijzigingen en drug behandelingen. Deze procedure heeft ook het voordeel van het toestaan van verlamming studies in parallel met andere gedrags metingen, een belangrijke functie in moleculaire screening studies worden uitgevoerd.
De resultaten die tot dusver zijn bereikt in de programma’s van drugs, ontdekking van AD15,34,35 en PD18 tonen het belang van breed veld-of-view data-acquisitie bij het aanzienlijk vergroten van de het aantal dieren die in een enkele experiment, daardoor aanzienlijk verminderen de experimentele fouten en sterk verbeteren van de statistische validiteit van studies kunnen worden gecontroleerd. Terwijl de huidige in dit protocol beschreven aanpak heeft gericht op het aanpakken van de uitdagingen op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling, wij hopen dat de methodologie algemeen zal worden aangenomen in de Gemeenschap, en dat de toepassing ervan zal worden uitgebreid tot complexe genetische en Behavioral studies en breid de fenotypen die momenteel worden opgespoord.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door het centrum voor Misfolding ziekten (CMD). FAA wordt ondersteund door een Senior Research Fellowship award van de Alzheimer’s Society, Groot-Brittannië (Grant nummer 317, AS-SF-16-003). De stammen van C. elegans werden verkregen vanaf de Caenorhabditis elegans genetische centrum (CGC).
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |