Объем является важным параметром относительно характеристик физиологических и патологических клеток. Мы описываем флуоресцентный исключения метод, позволяющий полный поле измерения объема в vitro нейронов с югу Микрометрический осевой резолюции, необходимые для анализа невритов и динамические структуры, подразумевается в нейрональных роста.
Объем является важным параметром относительно характеристик физиологических и патологических нейронов в различных масштабах времени. Нейроны являются довольно уникальный клетки относительно их расширенной разветвленной морфологии и следовательно поднять ряд методологических проблем для измерения объема. В конкретном случае в vitro нейрональных роста выбранной методологии должен включать югу Микрометрический осевой резолюции, в сочетании с полный поле наблюдения на временных масштабах от минут до часов или дней. В отличие от других методов, как клетки форму реконструкция с использованием конфокальная томография, электрически на основе измерения или атомной силовой микроскопии недавно разработанный метод исключения флуоресцирования (FXm) имеет потенциал для выполнения этих задач. Однако хотя простые в своем принципе, осуществление разрешением FXm для нейронов требует несколько корректировок и посвященный методологии. Мы представляем здесь метод, основанный на сочетании флуоресценции отчуждения, низкой шероховатости несколькими отсеков microfluidic приборы и, наконец, micropatterning для достижения в vitro измерения объема местных нейронов. Высоким разрешением, предоставляемых устройством позволили нам измерить объем местных нейрональные процессы (невритов) и объем некоторых конкретных структур, участвующих в нейрональных роста, такие как конусы роста (ГСК).
Точное знание клеточного объема привлекла повышенное внимание в последние годы, движимый выпуск гомеостаза размер ячейки в одноклеточных микроорганизмов 1 и в целом в митотическая клетки 2. Однако вопрос о объема клетки уместно также для пост митотическая ячеек, для которых нейроны представляют собой парадигматический пример.
Объем является действительно важным подпись физиологические и патологические события в различных масштабах и моменты времени в нейрональных жизни, от переходных аксональное деформации, связанные с электрической активности (шкала миллисекунды) 3 к необратимым нейронов, отеки, происходящих во время бессимптомной фазы нейродегенеративных заболеваний (годами в организме человека) 4. Однако большой объем изменений происходит в промежуточные сроки дней или недель (в зависимости от рассматриваемых организма) во время роста нейронов. Расширенный и сложных морфологией нейронов поднимает вопросы кратные, среди которых регулирование размера ячейки. Аксональное Длина и диаметр являются действительно жестко регулируется в естественных условиях, с конкретных значений для каждого типа нейронов 5,6.
Эти вопросы, сложные решения в естественных условиях, могут также рассматриваться в упрощенном виде в пробирке. В этой цели метод, посвященный измерение объема быстро достаточно, чтобы следить за динамикой роста (т.е. в масштабе времени минут) и совместимы с наблюдения за несколько часов или дней не требуется. Несколько методов были разработаны с годами для обеспечения прямого или косвенного доступа к сотовой тома в пробирке. Реконструкция ячейки от конфокальная томография является одним из них, но этот метод подразумевает маркировки и повторные воздействия света, показывая ограниченной осевой разрешением около 500 Нм 7. Обратите внимание, что эти два последних недостатки частично преодолеть, более сложные и последние метод с именем решетка свет лист микроскопии 8. Атомная силовая микроскопия был используется 9 , но этот способ является по своей сути, медленно и утомительно. Кроме того физический контакт, который требует с ячейки могут помешать с измерением, учитывая крайняя мягкость нейронов 10. Косвенный метод, с помощью импеданс или резонанс использовались для различных клеточных типов 11, но распространяются недостаточно для клея клетки как нейронов.
Один из наиболее перспективных методов основан на меру исключенного объема клетки в тесной камере, заполнены с флуоресцентной краской. Метод исключения флуоресцирования (FXm) прост в своем принципе как требует не маркировки и подходит для быстрого, долгосрочные оптических изображений клеточных популяций с потенциально югу оптического осевого резолюции. Более точно в резолюции в z зависит от интенсивности максимум флюоресценции в камере культуры (т.е. в регионе лишенный клетки) делится на динамический диапазон камеры, хотя несколько источников шума ограничить это окончательное урегулирование. Этот метод был очень мощный следовать объем миграции адэрентных клеток 12 или для изучения изменение объема при митозе клеток млекопитающих, как подробно описано в 13. Однако нейроны представляют методологической проблемой для компании FXm, учитывая их обширные ветвления в югу Микрометрический процессы.
Мы представляем здесь метод, ведущих к изготовления гладких FXm камер для доступа с высокой точностью объем и высота ветвей нейронов и динамических структур, участвующих в нейрональных роста как конусы роста.
Камеры должны иметь аналогичные высот, чем объект для измерения с целью оптимизации осевой резолюции. Таким образом мы разработали различные устройства компании FXm характеризуется палат Центральной измерения трех различных высот. Тонкий (3 мкм в высоту) предназначен для измерения neurite: это низкая высота исключает сома, которые остаются в ближайшем высокой Промежуточная камера 15 мкм. Толстые Центральная камер (10 и 12 мкм) являются недостаточно высокими для того, чтобы следовать за весь клеточный рост. Устройство также включает в себя два водохранилища, расположенные по обе стороны центральной камеры. Четыре отверстия впрыска (IH) таким образом реализованы и обозначаются следующим образом: на входе и выходе служат ввести клеточных суспензий в чип, тогда как два других канала водохранилищ.
У нас есть первый сфабрикованные калибровки coverslips для измерения высоты, с использованием структуры фоторезиста известных геометрии. Мы затем образ свободный рост нейронов, но также морфологически ограничением нейронов в micropatterns сцепления.
Объем изображений нейронов представляет собой проблему для компании FXm технику из-за длинные и тонкие расширения этих клеток. Этот протокол описывает варианты того же типа microfluidic устройства, посвященный нейрон imaging.
Рядом аспектов microfluidic дизайн выбор цели является основополагающим для флуоресценции исключения воображения и предполагает компромисс между латеральное разрешение и четкость изображения. В 13 показано, что высокая NA, ведущих к глубине фокус меньше, чем высота камеры не наносит ущерб для точности измерения объема, если изображений была исполнена на фокус и если осталось достаточно разницы между контур объекта я выигравшим и границы поверхности интеграции. Однако использование камеры гораздо выше, чем Глубина фокуса ухудшает четкость изображения благодаря Фотон диффузии, которая сглаживает края объектов, представляющих интерес. Изготовление высокой палаты 3 мкм сократить этот боковой размытие и предоставляется исключительно четко флуоресцентные исключения изображения даже с помощью высоких NA (0.8) 40 X цели визуализировать нейрональных отраслей с высоким боковыми резолюции.
Чип сборка является важным шагом, в частности в случае 3 мкм высокие камеры, но тщательного манипуляции, как описано в 4.1.2 избегает распада крыши. Поверхности высокое соотношение объема, связанные с эти тонкие камеры также поднял вопрос о стабильности декстрана концентрации со временем. Мы проверили, что поверхности поглощения декстрана после одной ночи инкубации был незначительным: после замены декстрана, PBS, разность интенсивности между опорой и фон был приблизительно 1 на 1000 первоначального интенсивности контраст между Эти два региона в присутствии декстрана. Обратите внимание, что нейроны могут осаждаться и на нижнем coverslip на крыше PDMS. Этот эффект исчезает при использовании узорной coverslips (т.е. когда мы не инкубировать адгезивные молекулы в зале PDMS), как покрытие поэтому строго локализуется в нижней части камеры.
Помимо их сложной морфологией нейронов скорее подходит для компании FXm с тем, что одним из основных ограничений метода, т.е. декстрана эндоцитоза, является весьма ограниченным в этих клетках. Мы выбираем 10 кДа формулировка для подавления в долгосрочной перспективе диапазон (в часах) каких-либо видимых эндоцитоза явлений.
В заключение концептуальной простоты FXm уравновешивается набор экспериментальных вопросов, которые были решены настоящего Протокола, такие как нанометрические PDMS шероховатости и высота Микрометрический камеры или фоновая поправка для устранения неравномерности потолок PDMS между столбами. Однако использование тесном microfluidic палаты ограничиться флуоресцентные среднего дает несколько конкретных ограничений как необходимость поддержки столбов, который понижает эффективной поверхности, доступные для клеточной адгезии, или необходимость исключить сома из Центральной камеры для наблюдения нейрональных расширений с высокой ясностью, который ограничивает регионах ячейки доступными для наблюдения высокого разрешения. Одной возможной эволюции этого метода будет избавиться от этой физической изоляции, должны быть заменены одним оптическим. Новая разработка легких лист микроскопии могут быть объединены выгодно с компанией FXm в будущем.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотят признавать ChiLab, материалы и лабораторные Microsystems – Политехнического ди Торино – DISAT, в лице профессора C F Pirri, д-р M Cocuzza и д-р S L Marasso, за их ценные поддержку в процесс разработки и изготовления устройств. Мы благодарим Виктора Racine от Quantacell для обсуждения и поддержку в обработке изображений. Мы благодарны Isabelle Гранджин и Манон Шартье животных фонда Institut Curie для их поддержки для мышей и Пабло Варгас и Ана-Мария Леннон (Institut Кюри) за предоставление нам GFP LifeAct мышей. Мы благодарны Оливье Thouvenin от Institut Langevin и Клотильда Cadart, Лариса Venkova и Matthieu Piel от Institut Кюри – UMR 144, за их помощь в понимании флуоресценции исключения метод. Наконец мы благодарим технологической платформы Institut Пьер-Жиль де жен (CNRS UMS 3750) за их поддержку в микротехнологий. Эта работа частично поддержали европейских исследований Совета дополнительно грант № 321107 «Виолончель,» Université PSL (проект SwithNeuroTrails), практический НРУ будущее и ИНГГ Labex и Equipex.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |