Volumen ist ein wichtiger Parameter zur physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Zellen. Wir beschreiben eine fluoreszierende Ausschluss-Methode, flächenhafte Messung von in-vitro- neuronale Volumen mit Sub mikrometrische axiale Auflösung benötigt für die Analyse von Neuriten und dynamische Strukturen in neuronale Wachstum impliziert.
Volumen ist ein wichtiger Parameter zur physiologischen und pathologischen Eigenschaften der Neuronen auf unterschiedlichen Zeitskalen. Neuronen sind ziemlich einzigartig Zellen über ihre erweiterte verzweigten Morphologien und erhöhen folglich mehrere methodische Herausforderungen für Volumen-Messung. Im besonderen Fall von in-vitro- neuronale Wachstum sollte die gewählte Methodik Sub mikrometrische axiale Auflösung, kombiniert mit Vollfeld Beobachtung auf Zeitskalen von Minuten, Stunden oder Tage umfassen. Im Gegensatz zu anderen Methoden wie Zelle Form Wiederaufbau mit konfokale Bildgebung, elektrisch-basierten Messungen oder Atomic Force Microscopy hat die neu entwickelte Fluoreszenz-Ausschluss-Methode (FXm) das Potenzial, diese Herausforderungen zu erfüllen. Obwohl es einfach in seinem Prinzip, erfordert jedoch Umsetzung einer hochauflösenden FXm für Neuronen, mehrere Anpassungen und eine spezielle Methodik. Wir stellen Ihnen hier eine Methode basiert auf der Kombination von Fluoreszenz Ausgrenzung, niedrig-Rauhigkeit Multi-Fächer mikrofluidischen Geräten und schließlich Micropatterning, in-vitro- Messung der lokalen neuronalen Volumen zu erreichen. Die hohe Auflösung zur Verfügung gestellt vom Gerät konnten wir messen das lokale Laufwerk von neuronalen Prozessen (Neuriten) und die Lautstärke etwas spezifischer Strukturen neuronale Wachstum, wie Wachstum Kegel (GCs) beteiligt.
Die genaue Kenntnis der zellulären Volumen hat erhöhte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren angezogen, angetrieben von der Frage der Zelle Größe Homöostase in einzelnen-celled Mikroorganismen 1 und ganz allgemein in der mitotischen Zellen 2. Allerdings ist die Frage des Zellvolumens relevant auch für Post-mitotischen Zellen, für die Neuronen ein Paradebeispiel dar.
Volumen ist in der Tat eine wichtige Unterschrift der physiologischen und pathologischen Veranstaltungen auf verschiedenen Skalen und Zeitpunkten im neuronalen Leben von transienten axonalen Verformung elektrische Aktivität (Millisekunden Skala) 3 , die irreversible zugeordnet neuronale Schwellung auftreten während der asymptomatischen Phase der neurodegenerativen Erkrankungen (über Jahre beim Menschen) 4. Allerdings tritt die größte Volumenänderung in Zwischenzeit Maßstab von Tagen oder Wochen (abhängig von der betrachteten Organismus) während des neuronalen Wachstums. Die ausgedehnte und komplexe Morphologie der Neuronen wirft Fragen auf ein Vielfaches, unter denen die Regulierung der Zellengröße. Axonalen Länge und Durchmesser sind in der Tat streng regulierten in Vivo, mit Werten spezifisch für jedes neuronaler Typ 5,6.
Diese Fragen, komplex, um in Vivo, Adresse können auch in vereinfachter Form angesprochen werden in-vitro-. In diesem Ziel eine Methode gewidmet Volumenmessung schnell genug Wachstumsdynamik (d. h. in einer Zeitskala von Minuten) und kompatibel mit Beobachtung über Stunden oder Tage zu folgen ist erforderlich. Verschiedene Methoden wurden im Laufe der Jahre zu einer direkten oder indirekten Zugriff auf zelluläre Volumen in Vitroentwickelt. Zelle Rekonstruktion von confocal Imaging ist einer von ihnen, aber diese Methode impliziert Etikettierung und wiederholten Expositionen gegenüber Licht und zeigt eine begrenzte axiale Auflösung von ca. 500 nm 7. Beachten Sie, dass diese zwei letzten Nachteile durch eine anspruchsvolle und aktuelle Methode namens Gitter Licht-Blatt Mikroskopie 8teilweise überwunden werden. Atomic Force Microscopy hat gebrauchte 9 aber diese Scan-Methode ist durch Wesen langsam und mühsam. Darüber hinaus kann der Körperkontakt, die, den es mit der Zelle erfordert, die Messung, wenn man bedenkt die extreme Weichheit der Neuronen 10beeinträchtigen. Indirekte Methode mittels Impedanz oder Resonanz haben für verschiedene Zelltypen 11, aber sind nicht ausreichend für erweitert anhaftende Zellen wie Neuronen eingesetzt.
Eine der vielversprechendsten Methoden basiert auf das Maß der ausgeschlossenen Volumen von Zellen in einer engen Kammer gefüllt mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Die Fluoreszenz-Ausschluss-Methode (FXm) ist einfach in seinem Prinzip, da es erfordert keine Kennzeichnung und eignet sich für schnelle, langfristige optische Bildgebung der Zell-Populationen mit einer potenziell Sub optische axiale Auflösung. Genauer gesagt, hängt die Auflösung in z die maximale Fluoreszenzintensität in der Kultur-Kammer (d. h. in Region frei von Zellen) geteilt durch den Dynamikbereich der Kamera, obwohl mehrere Schallquellen dieser ultimative Auflösung begrenzen. Diese Methode ist sehr mächtig, das Volumen der Migration von adhärenten Zellen 12 folgen oder Volumenänderung während der Mitose von Säugerzellen, wie gründlich in 13beschrieben zu studieren gewesen. Neuronen bilden jedoch eine methodische Herausforderung für FXm unter Berücksichtigung ihrer umfangreichen Verzweigung in Sub mikrometrische Prozesse.
Wir stellen Ihnen hier eine Methode führt zur Herstellung von glatten FXm Kammern zugänglich mit hoher Präzision die Lautstärke und Höhe des neuronalen Verzweigungen und dynamische Strukturen neuronale Wachstum wie Wachstum Kegel beteiligt.
Kammern müssen ähnliche Höhen als das Objekt zu messen, um axiale Auflösung optimieren. Daher haben wir verschiedene FXm-Geräte zeichnen sich durch zentrale Messung Kammern mit drei verschiedenen Höhen entwickelt. Die dünnste (3 µm in der Höhe) widmet sich der Neurit Messung: dieser niedrigen Höhe schließt Soma, die bleiben in der in der Nähe von 15 µm hohen Zwischenkammer. Dickere zentrale Kammern (10 und 12 µm) sind hoch genug, um die ganze Zelle Wachstum folgen. Das Gerät beinhaltet auch zwei Reservoirs befindet sich auf beiden Seiten der zentralen Kammer. Vier Löcher in Injektion (IH) sind so umgesetzt und werden wie folgt bezeichnet: den Einlass und Auslass einzuführen die zellulären Suspensionen in den Chip dienen, während die beiden anderen Stauseen ernähren.
Wir haben erste fabrizierten Kalibrierung Deckgläsern für Höhenmessungen mit Fotolack Strukturen der bekannter Geometrie. Wir haben dann frei wachsenden Neuronen, sondern auch morphologisch abhängigen Neuronen in Micropatterns der Adhäsion abgebildet.
Volumen-Bildgebung von Neuronen stellt eine Herausforderung für die FXm-Technik durch die langen und dünnen Erweiterungen dieser Zellen. Dieses Protokoll beschreibt Varianten des gleichen Typs von mikrofluidischen Gerät Neuron Bildgebung gewidmet.
Neben den Aspekten von mikrofluidischen Design die Wahl des Ziels ist von grundlegender Bedeutung für die Fluoreszenz Ausgrenzung Bildgebung und impliziert einen Kompromiss zwischen Ortsauflösung und die Bildschärfe. Es hat 13 gezeigt, dass eine hohe NA führt zu einer Tiefenschärfe kleiner als die Höhe der Kammer war nicht nachteilig für die Präzision der Volumenmessung, wenn Bildgebung mit Schwerpunkt durchgeführt wurde und wenn ein ausreichender Spielraum zwischen die Kontur des Objekts der ich gelassen wird Geschäftsgelegenheiten und die Grenzen der Integration Oberfläche. Allerdings beeinträchtigt die Verwendung einer Kammer deutlich höher als die Schärfentiefe der Bildschärfe durch Photon Diffusion, welche glättet die Kanten der Objekte von Interesse. Die Herstellung einer hohen Kammer mit 3 µm reduziert das seitliche Weichzeichnen und lieferte außergewöhnlich gut definierten fluoreszierende Ausgrenzung Bilder auch mit hohen NA (0,8) 40 X Ziele neuronale Verzweigungen mit hoher Ortsauflösung zu visualisieren.
Chip-Montage ist ein entscheidender Schritt, insbesondere bei 3 µm hohen Kammern, aber vorsichtig Manipulation wie unter 4.1.2 vermeidet den Zusammenbruch des Daches. Die hohe Fläche zum Volumenverhältnis, diese dünnen Kammern zugeordnet Frage auch die der Stabilität der Dextran Konzentration im Laufe der Zeit. Wir haben überprüft, ob die Oberflächenabsorption der Dextran nach einer Nacht der Inkubation unbedeutend war: nach Dextran durch PBS ersetzt, der Unterschied der Intensität zwischen der Säule und der Hintergrund war etwa 1 pro 1000 der Anfangsintensität Kontrast zwischen Diese beiden Regionen in Anwesenheit von Dextran. Beachten Sie, dass Neuronen auf der Unterseite Deckglas und auf dem Dach des PDMS halten können. Dieser Effekt verschwindet, wenn mit gemusterten Deckgläsern (d. h. wenn wir nicht anhaftende Moleküle innerhalb der PDMS-Kammer inkubieren), wie die Beschichtung auf der Unterseite der Kammer daher streng lokalisiert.
Abgesehen von ihrer anspruchsvollen Morphologie Neuronen eignen sich eher für FXm aufgrund der Tatsache, dass eine erhebliche Einschränkung der Methode, d. h. Dextran Endozytose, sehr begrenzt ist in diesen Zellen. Wir wählen eine 10 kDa Formulierung langfristig unterdrücken reichen (in Stunden) sichtbaren Endozytose Phänomene.
Zusammenfassend ist die konzeptionelle Einfachheit der FXm durch eine Reihe von experimentellen Probleme ausgeglichen, die durch dieses Protokoll, z. B. nanometrischen PDMS Rauheit und mikrometrische Kammer Höhe oder Untergrundkorrektur für die Unebenheiten korrigieren gelöst wurden die PDMS Decke zwischen Säulen. Die Verwendung einer engen mikrofluidischen Kammer zu beschränken, das fluoreszierende Medium führt jedoch ein paar spezifische Einschränkungen wie die Notwendigkeit der Unterstützung Säulen, die die wirksame Oberfläche für Zelladhäsion oder die Notwendigkeit der zentralen Soma ausschließen senkt Kammer, neuronale Erweiterungen mit der höchsten Klarheit zu beobachten, die Regionen der Zelle für hochauflösende Beobachtung zugänglich einschränkt. Eine mögliche Weiterentwicklung dieser Methode wäre get rid of dieser physischen Entbindung durch eine optische ersetzt werden. Die Neuentwicklung des Lichtblattmikroskopie könnte in Zukunft vorteilhaft mit FXm kombiniert werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren ChiLab, Materialien und Microsystems Labor – Politecnico di Torino – DISAT, in der Person von Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza und Dr. S L Marasso, bestätigen möchten für ihre wertvolle Unterstützung bei der Prozessentwicklung und Gerät Herstellung. Wir danken Victor Racine von Quantacell für Diskussion und Unterstützung in der Bildverarbeitung. Wir sind dankbar, Isabelle Grandjean und Manon Chartier von Animal Facility des Institut Curie für ihre Unterstützung für Mäuse, und Pablo Vargas und Ana-Maria Lennon (Institut Curie) für die Bereitstellung von uns mit der GFP LifeAct Mäusen. Wir sind dankbar, Olivier Thouvenin vom Institut Langevin und Clotilde Cadart, Larisa Venkova und Matthieu Piel vom Institut Curie – UMR 144, für ihre Hilfe für das Verständnis der Fluoreszenz unter Ausschluss Methode. Zu guter Letzt danken wir die technologische Plattform der Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) für ihre Unterstützung in Microfabrication. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der europäischen Forschung Rat Advanced Grant Nr. 321107 “CellO” PSL Université (SwithNeuroTrails Projekt), ANR Investissement Avenir und IPGG Labex und Equipex.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |