容积是细胞生理病理特征的重要参数。我们描述了一种荧光排除方法, 允许对神经生长所隐含的突起和动态结构进行分析所需的亚测微轴向分辨率的体外神经元体积的全场测量。
体积是不同时间尺度神经元生理病理特征的重要参数。神经元是相当独特的细胞, 其扩展分支形态, 从而提出了一些方法上的挑战, 体积测量。在体外神经元生长的特殊情况下, 所选择的方法应包括测微轴向分辨率, 并结合对时间尺度的全场观测, 从几分钟到几小时或几天。不像其他方法, 如细胞形状重建使用共焦成像, 电基测量或原子力显微镜, 最近开发的荧光排除方法 (FXm) 有潜力, 以满足这些挑战。然而, 尽管它的原理很简单, 但实现神经元高分辨率 FXm 需要进行多重调整和一个专用的方法。本文提出了一种基于荧光排斥、低粗糙度多室微流控器件的组合方法, 最后 micropatterning 实现了局部神经元体积的体外测量。该设备提供的高分辨率使我们能够测量神经元过程的局部体积 (突起) 和某些特定结构的体积, 如生长锥 (gc)。
近年来, 由于单细胞微生物的细胞大小动态平衡 ( 1 , 更普遍地是有丝分裂细胞2), 细胞体积的精确知识引起了人们越来越多的关注。然而, 细胞体积问题也与有丝分裂后细胞有关, 神经元构成了一个典型的例子。
体积的确是神经元生命中不同尺度和时间点的生理和病理事件的重要标志, 从与电活动相关的瞬态轴索形变 (毫秒刻度) 3到不可逆转的神经元肿胀发生在神经退行性疾病的无症状阶段 (在人类年) 4。然而, 最大的体积变化发生在一个中间时间尺度的天或周 (取决于被考虑的有机体) 在神经元生长。神经元的扩展和复杂形态学引起倍数问题, 其中细胞大小的调节。轴突长度和直径确实是严格的调节在体内, 每个神经元类型5,6特定的值。
这些问题, 复杂到地址在体内, 也可以用简化的方式来解决在体外.在这个目标中, 一个专门用于体积测量的方法, 它能够快速地跟踪增长动态 (例如, 在时间刻度中为), 并与在数小时或几天内的观察相兼容。多年来, 已经开发了几种方法, 以便直接或间接地访问细胞体积体外。共焦成像的细胞重建是其中之一, 但这种方法意味着标记和重复曝光, 同时显示有限的轴向分辨率约500毫微米7。请注意, 这两个最后的缺点是部分克服了一个更复杂和最近的方法, 称为格子光片显微镜8。原子力显微镜已经使用了9 , 但这种扫描方法本质上是缓慢和繁琐的。此外, 它需要与细胞的物理接触可能干扰的测量考虑到神经元的极端柔软性10。使用阻抗或共振的间接方法已用于不同的细胞类型11, 但不适用于像神经元这样的扩展粘接细胞。
最有希望的方法之一是建立在封闭腔内填充荧光染料的细胞被排除体积的测量。荧光排除法 (FXm) 在其原理上是简单的, 因为它不需要标注, 并且适用于具有潜在亚光学轴向分辨率的细胞群的快速、长期光学成像。更确切地说, z 的分辨率取决于培养室中的最大荧光强度 (即区域内没有单元格) 除以相机的动态范围, 尽管有几个噪声源限制了这个最终分辨率。此方法非常强大, 可以跟踪迁移粘附单元格12的体积, 也可以研究哺乳动物细胞有丝分裂过程中的体积变化, 如13中详细描述的那样。然而, 神经元构成了 FXm 考虑其广泛的分测微过程的方法学挑战。
我们在这里提出了一个方法, 以使光滑的 FXm 室, 以高精度访问的数量和高度的神经元分支和动态结构涉及神经元生长如生长锥。
为了优化轴向分辨率, 硐室应具有与所测量物体相似的高度。因此, 我们设计了不同的 FXm 设备的特点是中央测量室的三不同的高度。最薄 (3 µm 在高度) 专门用于突起测量: 这个低高度不包括躯体, 保持在近15µm 高中间室。较厚的中央腔 (10 和12µm) 足够高, 以跟踪整个细胞的生长。该装置还包括位于中心腔两侧的两个储层。四射入孔 (IH) 因而被执行并且被选定如下: 入口和出口为介绍细胞悬浮入芯片, 而另外二其他哺养水库。
我们首先用已知几何的光刻胶结构制造高度测量的校准盖玻片。然后我们想象了自由生长的神经元, 还有形态上受约束的神经元 micropatterns 的黏附力。
由于这些细胞的长而薄的延伸, 神经元的体积成像对 FXm 技术构成了挑战。本协议描述了用于神经元成像的同类型微流控装置的变体。
在微流控设计方面, 目标的选择是荧光排除成像的基础, 意味着横向分辨率和图像清晰度之间的权衡。在13中显示, 如果在焦点上进行成像, 并且在对象的轮廓之间留有足够的边距, 则导致焦点小于腔高的深度的高 NA 不会对体积测量的精度造成不利影响。本金和集成曲面的边界。然而, 由于光子扩散, 使用比聚焦深度高得多的腔会削弱图像的清晰度, 从而使感兴趣对象的边缘平滑。3µm 高室的制作减少了这种侧向模糊, 并提供了异常明确的荧光排除图像, 即使使用高 NA (0.8) 40X 目标, 以可视化高横向分辨率的神经分支。
芯片组装是一个关键步骤, 特别是在3µm 高室的情况下, 但谨慎操作, 如4.1.2 所述避免了屋顶的倒塌。与这些薄腔相关联的高表面体积比也引发了葡聚糖浓度随时间推移的稳定性问题。我们检查了在一夜的孵化后, 葡聚糖的表面吸收是微不足道的: 在用 PBS 代替葡聚糖后, 柱与背景之间强度的差异约为最初强度对比度的1至1000。这两个地区在葡聚糖的存在。请注意, 神经元可能会粘附在底部盖玻片和在其顶部。此效果在使用图案化盖玻片(即当我们不在其内部孵化粘附分子时) 消失, 因为因此涂层严格地在腔底上进行了定位。
除了具有挑战性的形态学, 神经元是相当适合 FXm, 因为这一事实的一个主要限制的方法,即葡聚糖吞, 是非常有限的这些细胞。我们选择一个 10 kDa 的配方, 以抑制在长范围 (小时) 任何可见的吞现象。
总之, FXm 的概念简单性是由本协议所解决的一系列实验问题所平衡的, 如纳米和测微室高度, 或背景校正, 以纠正不均匀的两根柱子之间的天花板。然而, 使用关闭微流控腔来限制荧光介质产生一些特定的限制, 如需要支撑柱, 降低有效的表面可用于细胞黏附, 或必须排除体细胞从中央室观察神经元的扩展与最高清晰度, 这限制了细胞区域的高分辨率观察。这个方法的一个可能的演变将是摆脱这个物理禁闭, 被光学一个替换。光片显微术的新发展可能会与 FXm 的未来相结合。
The authors have nothing to disclose.
作者想确认 ChiLab, 材料和微系统实验室-米兰理工大学 DISAT, 在教授 Pirri, M Cocuzza 博士和 Marasso 博士的人, 为他们在过程开发和设备制造的宝贵支持。我们感谢 Quantacell 的维克多。我们感谢 Grandjean 和万伦 Chartier 从居里研究所的动物设施中支持小鼠, 以及为我们提供 GFP LifeAct 小鼠的和安娜-玛丽亚列侬 (居里研究所)。我们感谢 Thouvenin 从居里-拉里沙 144 Langevin 和 Clotilde Cadart、Venkova 马修和 Piel UMR, 帮助他们理解荧光排除方法。最后, 我们感谢皮埃尔-Gennes (CNRS 3750) 技术平台在微细加工方面的支持。这项工作得到部分支持, 由欧洲研究理事会高级赠款321107号 “大提琴”, 大学 (SwithNeuroTrails 项目), Investissement 艾文莉, IPGG Labex 和 Equipex。
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |