وحدة التخزين معلمة هامة فيما يتعلق بالخصائص الفسيولوجية والمرضية للخلايا. يصف لنا طريقة استبعاد فلورسنت السماح الكامل-ميدان قياس حجم الخلايا العصبية في المختبر مع القرار المحوري مكرمترك الفرعية المطلوبة لتحليل نيوريتيس والهياكل الحيوية ضمناً في نمو الخلايا العصبية.
وحدة التخزين معلمة هامة فيما يتعلق بالخصائص الفسيولوجية والمرضية للخلايا العصبية في نطاقات زمنية مختلفة. الخلايا العصبية خلايا فريدة من نوعها تماما فيما يتعلق بما مورفولوجيس متشعب الموسعة وبناء على ذلك رفع العديد من التحديات المنهجية لقياس حجم. في حالة خاصة في المختبر نمو الخلايا العصبية، المنهجية المختارة ينبغي أن يتضمن القرار المحوري الفرعي مكرمترك جنبا إلى جنب مع المراقبة الميدانية الكاملة على جداول زمنية من دقائق إلى ساعات أو أيام. على عكس الأساليب الأخرى مثل التعمير شكل الخلية باستخدام التصوير [كنفوكل]، والقياسات كهربائياً أو “مجهر القوة الذرية”، أسلوب الاستبعاد Fluorescence المطورة حديثا (FXm) لديه القدرة على الوفاء بهذه التحديات. ومع ذلك، على الرغم من كونها بسيطة في مبدئه، يتطلب تنفيذ FXm عالية الاستبانة للخلايا العصبية تعديلات متعددة ومنهجية مخصصة. نحن الحاضرين هنا أسلوب يقوم على المزيج من استبعاد الأسفار وأجهزة موائع جزيئية مقصورات متعددة منخفضة-خشونة وأخيراً ميكروباتيرنينج لتحقيق في المختبر قياسات حجم الخلايا العصبية المحلية. عالية الدقة التي يوفرها الجهاز يسمح لنا بقياس حجم العمليات العصبية (نيوريتيس) المحلية وحجم بعض هياكل محددة تشارك في نمو الخلايا العصبية، مثل النمو والأقماع (الرابطة).
معرفة دقيقة بحجم الهاتف الخلوي قد اجتذب اهتماما متزايداً في السنوات الأخيرة، مدفوعا بمسألة التوازن حجم الخلية في الكائنات الحية الدقيقة وحيدة الخلية 1 وأعم في الخلايا الانقسامية 2. ومع ذلك، مسألة حجم الخلية وثيق الصلة أيضا بالخلايا الانقسامية اللاحقة، التي يشكل فيها الخلايا العصبية مثال نموذجية.
وحدة التخزين في الواقع توقيع هامة من الأحداث الفسيولوجية والمرضية في جداول مختلفة والنقاط الزمنية في حياة الخلايا العصبية، من تشوه محواري عابر المرتبطة بالنشاط الكهربائي (مقياس ميلي ثانية) 3 إلى لا رجعة فيها الخلايا العصبية تورم التي تحدث أثناء مرحلة أعراض الأعصاب من الأمراض (على مدى السنوات في البشر) 4. ومع ذلك، يحدث تغيير حجم أكبر في مقياس وقت متوسط لمدة أيام أو أسابيع (اعتماداً على الكائن الحي المدروس) أثناء نمو الخلايا العصبية. مورفولوجية موسعة ومعقدة من الخلايا العصبية ويثير قضايا مضاعفات، منها تنظيم حجم الخلية. محواري طول وقطر في الواقع أحكام التنظيم في فيفو، مع القيم المحددة لكل نوع الخلايا العصبية 5،6.
ويمكن أيضا معالجة هذه المسائل، معقدة لمعالجة في فيفو، بطريقة مبسطة في المختبر. في هذا الهدف، مكرسة لقياس حجم سريعة ما يكفي لتتبع ديناميات النمو (أي في مقياس وقت الدقائق) ومتوافق مع المراقبة على مدى ساعات أو أيام مطلوب أسلوب. وقد وضعت العديد من الأساليب على مر السنوات لتوفير وصول مباشر أو غير مباشر لحجم الخلايا في المختبر. إعمار خلية من تصوير [كنفوكل] واحد منهم، ولكن هذا الأسلوب يعني وضع العلامات وتكرار التعرض للضوء أثناء عرض قرار محوري محدودة من شمال البحر الأبيض المتوسط حوالي 500 7. ملاحظة التغلب على هذه العوائق الماضية اثنين جزئيا بأسلوب أكثر تطورا ومؤخرا باسم شعرية مجهرية الضوء-ورقة 8. مجهر القوة الذرية كانت تستخدم 9 ولكن هذا الأسلوب المسح بجوهر بطيئة وشاقة. وعلاوة على ذلك، قد تتداخل الاتصال الجسدي فإنه يتطلب مع الخلية بقياس النظر ليونة المتطرفة من الخلايا العصبية 10. وقد استخدمت الأسلوب غير المباشر باستخدام مقاومة أو صدى لأنواع مختلفة من الخلايا 11، ولكن غير كافية لتمدد التصاق الخلايا مثل الخلايا العصبية.
أحد الأساليب الواعدة يستند إلى مقياس لحجم الخلايا في إغلاق غرفة مملوءة بصبغة فلورسنت المستبعدة. طريقة الاستبعاد الفلورية (FXm) بسيط في مبدئه أنها تتطلب لا وضع العلامات، ومناسبة للتصوير الضوئية سريعة وطويلة الأجل السكان خلية مع قرار محوري يحتمل أن تكون شبه ضوئية. أكثر دقة، القرار في ض يعتمد على كثافة fluorescence الحد الأقصى في دائرة الثقافة (أي في منطقة تخلو من الخلايا) مقسوماً على النطاق الديناميكي للكاميرا، على الرغم من أن يحد هذا القرار في نهاية المطاف من عدة مصادر للضوضاء. وكان هذا الأسلوب قوي جداً لمتابعة حجم ترحيل الخلايا ملتصقة 12 أو لدراسة تغير وحدة التخزين أثناء الانقسام خلايا الثدييات، كما هو موضح تماما في 13. ومع ذلك، تشكل الخلايا العصبية تحديا منهجياً للنظر على التبعات الواسعة في العمليات الفرعية مكرمترك FXm.
ونقدم هنا طريقة تؤدي إلى تصنيع الدوائر FXm السلس للوصول بدقة عالية الحجم وارتفاع فروع العصبية وديناميكية الهياكل المعنية في نمو الخلايا العصبية مثل الأقماع النمو.
ينبغي أن يكون للدوائر مرتفعات مماثلة من الكائن إلى قياس من أجل تحسين القرار المحوري. ولذلك، قمنا بتصميم أجهزة FXm مختلفة تتسم بقياس وسط دوائر ثلاث ارتفاعات مختلفة. أنحف (3 ميكرومتر في الطول) مكرس لقياس نورت: يستثني هذا الارتفاع المنخفض سوما، التي تبقى في قاعة 15 ميكرون متوسطة عالية القريب. الدوائر المركزية أكثر سمكا (10 و 12 ميكرومتر) عالية بما فيه الكفاية لمتابعة نمو الخلية كلها. ويشمل الجهاز أيضا خزانان الموجود على أي من جانبي الدائرة المركزية. وبالتالي تنفذ أربع حقن الثقوب (IH) وتم تعيينها كما يلي: مدخل ومخرج يؤدي إلى إدخال المعلقات الخلوية في الرقاقة، بينما الاثنان الآخران تغذية الخزانات.
ولدينا أول كوفيرسليبس المعايرة ملفقة لقياسات الارتفاع استخدام الهياكل مقاوم الضوء للهندسة المعروفة. ونحن قد ثم تصويرها الخلايا العصبية المتزايدة مجاناً، ولكن أيضا شكلياً مقيدة من الخلايا العصبية إلى ميكروباتيرنس للالتصاق.
تصوير حجم الخلايا العصبية يشكل تحديا لتقنية FXm بسبب امتدادات طويلة ورقيقة من هذه الخلايا. ويصف هذا البروتوكول المتغيرات من نفس نوع الجهاز موائع جزيئية مكرسة لتصوير الخلايا العصبية.
بجانب من جوانب تصميم موائع جزيئية، اختيار الهدف أساسي لتصوير استبعاد الأسفار ويعني مفاضلة بين القرار الأفقي ووضوح الصورة. وقد ثبت في 13 أن نا عالية مما يؤدي إلى عمق التركيز أصغر من ارتفاع الدائرة ليست ضارة لدقة قياس حجم إذا تم إجراء تصوير في التركيز وإذا ترك هامش كاف بين كفاف الكائن الأول الفوائد وحدود السطح التكامل. ومع ذلك، استخدام دائرة أعلى بكثير من عمق التركيز يضعف وضوح الصورة بسبب نشر فوتون، الذي ينعم حواف الكائنات ذات الاهتمام. تصنيع دائرة عالية 3 ميكرومتر تخفيض هذا التمويه الأفقي وقدمت صور الاستبعاد الفلورسنت محددة جيدا بشكل استثنائي حتى باستخدام نا عالية أهداف 40 (0.8) X لتصور فروع العصبية مع عالية الدقة الأفقي.
رقاقة تجميع خطوة حاسمة، وبخاصة في حالة 3 ميكرومتر الدوائر عالية، ولكن التلاعب بعناية كما هو موضح في 4.1.2 تجنب انهيار السقف. السطح ارتفاع نسبة التخزين المرتبطة بهذه الدوائر رقيقة آثار أيضا مسألة استقرار تركيز ديكستران على مر الزمن. لدينا محدداً أن امتصاص ديكستران السطح بعد ليلة واحدة من الحضانة كان لا يذكر: بعد استبدال ديكستران ببرنامج تلفزيوني، كان اختلاف الكثافة بين الدعامة والخلفية حوالي 1 لكل 1000 تباين كثافة الأولية بين هاتين المنطقتين حضور ديكستران. علما أن الخلايا العصبية قد يتقيد كل ساترة السفلي وعلى السطح PDMS. يختفي هذا التأثير عند استخدام منقوشة كوفيرسليبس (أي عندما لا يمكننا احتضان جزيئات لاصقة داخل قاعة PDMS)، كالطلاء لذلك مترجمة صارما على الجزء السفلي من الدائرة.
وبصرف النظر عن مورفولوجيا على التحدي، الخلايا العصبية مناسبة بدلاً من ذلك إلى FXm يرجع ذلك إلى حقيقة أن واحدة من القيد الرئيسي الأسلوب، أي ديكستران الالتقام، محدودة جداً في هذه الخلايا. علينا أن نختار من 10 تتراوح صياغة كاتشين لقمع في الطويلة (ساعات) أي الظواهر الالتقام مرئية.
وفي الختام، متوازنة بساطة FXm المفاهيمي بمجموعة من القضايا التجريبية التي حلت بهذا البروتوكول، مثل النانومترية PDMS خشونة وارتفاع دائرة مكرمترك، أو تصحيح الخلفية لتصحيح لتفاوت الحد الأقصى PDMS بين الأعمدة. ومع ذلك، غلة استخدام الدائرة موائع جزيئية الوثيق حصر المتوسطة الفلورسنت بعض القيود المحددة مثل الحاجة إلى ركائز الدعم، مما يقلل من سطح الفعالة المتاحة لالتصاق الخلايا، أو ضرورة استبعاد سوما من وسط دائرة مراقبة ملحقات الخلايا العصبية بوضوح أعلى، مما يحد من مناطق الخلية موجوداً للمراقبة عالية الدقة. وسيكون واحد التطور المحتمل لهذا الأسلوب للتخلص من هذا الحبس المادي، لتحل محلها أحد ضوئية. التنمية الجديدة للورقة الخفيفة الميكروسكوب يمكن أن يقترن مفيد FXm في المستقبل.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب تريد أن نعترف ChiLab والمواد والمختبر Microsystems-معهد البوليتكنيك في تورينو-ديسات، ممثلة في شخص الأستاذ ج و بيري والدكتور م كوكوزا والدكتور ماراسو L S، لدعمها الثمين في عملية تطوير وتصنيع الجهاز. ونحن نشكر فيكتور رأسين من كوانتاسيل للمناقشة والدعم في معالجة الصور. نحن ممتنون غرانجان إيزابيل وشارتييه مانون من “مرفق الحيوان” فارغاس بابلو ومعهد كوري لدعمهم للفئران، وأنا-ماريا لينون (معهد كوري) لتزويدنا بالفئران “ليفيكت التجارة والنقل”. نحن ممتنون “أوليفييه توفينين” من معهد لانجفان وكلوتيلد قدرة وفينكوبا لاريسا Piel ماتيو من معهد كوري-144 قاسم أغا، لمساعدتهم في فهم الاستبعاد Fluorescence الأسلوب. وأخيراً، نشكر البرنامج التكنولوجي لمعهد بيار-جيل دي جين (يزار مس 3750) لدعمهم في ميكروفابريكيشن. أيد هذا العمل جزئيا الأوروبية بحوث المجلس متقدمة المنحة رقم 321107 “التشيللو،” جامعة البولندي (مشروع سويثنيوروترايلس)، ANR Investissement دعفينير، وإيبج لابيكس واكويبيكس.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |