Il volume è un parametro importante per quanto riguarda le caratteristiche fisiologiche e patologiche delle cellule. Descriviamo un metodo di esclusione fluorescente che permette di pieno-campo misura di volume di un neurone in vitro con sub-micrometrica risoluzione assiale richiesto per l’analisi dei neuriti e strutture dinamiche implicite nella crescita neuronale.
Il volume è un parametro importante per quanto riguarda le caratteristiche fisiologiche e patologiche dei neuroni alle diverse scale temporali. I neuroni sono cellule piuttosto uniche per quanto riguarda la loro estese morfologie ramificate e conseguenza genera diverse sfide metodologiche per la misurazione del volume. Nel caso particolare di in vitro la crescita neuronale, la metodologia scelta dovrebbe includere sub-micrometrica risoluzione assiale combinato con osservazione di pieno campo su scale temporali da minuti a ore o giorni. A differenza di altri metodi come la cellula forma ricostruzione usando la formazione immagine confocal, misure basate su elettricamente o microscopia a forza atomica, il metodo di esclusione di fluorescenza (FXm) recentemente sviluppato ha il potenziale per soddisfare queste sfide. Tuttavia, pur essendo semplice nel suo principio, l’implementazione di un FXm ad alta risoluzione per i neuroni richiede regolazioni multiple e una metodologia dedicata. Presentiamo qui un metodo basato sulla combinazione di esclusione di fluorescenza, dispositivi microfluidici multi-compartimenti bassa rugosità e infine micropatterning per ottenere misurazioni in vitro del volume locale di un neurone. L’alta risoluzione fornita dal dispositivo ci ha permesso di misurare il volume locale di processi neuronali (neuriti) e il volume di alcune strutture specifici coinvolti nella crescita neuronale, come coni di crescita (GCs).
La conoscenza precisa del volume cellulare ha attirato l’attenzione aumentata negli ultimi anni, guidato dall’emissione di omeostasi di dimensione delle cellule in microrganismi unicellulari 1 e, più in generale, in cellule mitotiche 2. Tuttavia, la questione del volume delle cellule è pertinente anche per cellule post-mitotiche, per il quale i neuroni costituiscono un esempio paradigmatico.
Volume è infatti una firma importante degli eventi fisiologici e patologici alle diverse scale e intervalli di tempo in vita neuronale, da transitoria deformazione assonale associata alla attività elettrica (scala di millisecondo) 3 per l’irreversibile un neurone gonfiore che si verificano durante la fase asintomatica di neurodegenerative malattie (negli anni in esseri umani) 4. Tuttavia, la più grande variazione di volume si verifica in una scala di tempo intermedio di giorni o settimane (a seconda del microrganismo considerato) durante lo sviluppo neuronale. L’estesa e complessa morfologia dei neuroni solleva problemi multipli, tra cui la regolazione della dimensione della cella. Diametro e lunghezza assonale sono infatti strettamente regolato in vivo, con valori specifici per ogni tipo di un neurone 5,6.
Queste questioni, complessi da affrontare in vivo, anche possono essere affrontate in modo semplificato in vitro. A tale scopo, un metodo dedicato alla misurazione del volume veloce basta seguire il tasso di crescita (cioè in una scala di tempo di minuti) e compatibile con l’osservazione nel corso di ore o giorni è richiesto. Diversi metodi sono stati sviluppati nel corso degli anni per fornire un accesso diretto o indiretto a volume cellulare in vitro. Ricostruzione delle cellule da imaging confocale è uno di loro, ma questo metodo implica d’etichettatura e ripetute esposizioni alla luce pur mostrando una limitata risoluzione assiale di circa 500 nm 7. Si noti che questi due ultimi inconvenienti sono parzialmente superati mediante un metodo più recente e sofisticato denominato reticolo microscopia luce-foglio 8. Microscopia a forza atomica è stato usato 9 ma questo metodo di scansione è di essenza lento e noioso. Inoltre, il contatto fisico che richiede con la cella potrebbe interferire con la misurazione considerando l’estrema morbidezza di neuroni 10. Metodo indiretto tramite impedenza o risonanza sono state impiegate per cellulari differenti tipi di 11, ma sono insufficienti per esteso adesive cellule come i neuroni.
Uno dei metodi più promettenti si basa sulla misura del volume escluso delle cellule in una camera stretta, piena di una tintura fluorescente. Il metodo di esclusione di fluorescenza (FXm) è semplice nel suo principio in quanto non richiede alcuna etichettatura ed è adatto per l’imaging ottico veloce, a lungo termine delle popolazioni di cellule con una risoluzione assiale potenzialmente Sub-ottica. Più precisamente, la risoluzione in z dipende l’intensità della fluorescenza massima nella camera di coltura (cioè nella regione privo di cellule) divisa per la gamma dinamica della fotocamera, anche se diverse fonti di rumore limitano questa risoluzione definitiva. Questo metodo è stato molto potente per seguire il volume di migrazione delle cellule aderenti 12 o per studiare la variazione di volume durante la mitosi delle cellule di mammiferi, come accuratamente descritto in 13. Tuttavia, i neuroni costituiscano una sfida metodologica per FXm considerando la loro ampia ramificazione nei processi sub-micrometrici.
Presentiamo qui un metodo che conduce alla realizzazione di strutture liscia FXm alloggiamenti per accedere con alta precisione il volume e l’altezza di un neurone filiali e strutture dinamiche coinvolte nella crescita neuronale come coni di crescita.
Chambers dovrebbe avere altezze simili rispetto all’oggetto da misurare al fine di ottimizzare la risoluzione assiale. Pertanto, abbiamo progettato diversi dispositivi FXm caratterizzati da sezioni di misura centrale di tre diverse altezze. Il più sottile (3 µm in altezza) è dedicato alla misurazione del neurite: questa bassa altezza esclude soma, che rimangono nella camera intermedia alta, vicino 15 µm. Camere centrali più spesse (10 e 12 µm) sono sufficientemente elevate per seguire la crescita di cellule intere. Il dispositivo include anche due serbatoi situati su entrambi i lati della camera centrale. Quattro fori di iniezione (IH) così vengono implementate e sono designati come segue: l’ingresso e l’uscita servono ad introdurre le sospensioni cellulari nel chip, mentre gli altri due alimentare i serbatoi.
Abbiamo prima calibrazione fabbricato coprioggetti per le misurazioni di altezza con photoresist strutture geometriche conosciute. Abbiamo quindi abbiamo ripreso neuroni crescenti gratis, ma i neuroni anche morfologicamente vincolati in microfantasie di adesione.
Imaging con volumi di neuroni costituisce una sfida per la tecnica di FXm dovuto le estensioni lunghe e sottili di queste cellule. Questo protocollo descrive varianti dello stesso tipo di dispositivo microfluidico dedicata all’imaging del neurone.
Al lato degli aspetti della progettazione microfluidica, la scelta dell’obiettivo è fondamentale per l’imaging di fluorescenza esclusione e implica un compromesso tra la risoluzione laterale e la chiarezza di immagine. È stato dimostrato in 13 che un NA alta che porta ad una profondità di messa a fuoco più piccolo dell’altezza della camera non era dannoso per la precisione di misurazione di volume se imaging è stata eseguita a fuoco e se viene lasciato un margine sufficiente tra il contorno dell’oggetto di i nterest e i limiti della superficie di integrazione. Tuttavia, l’uso di una camera molto più alta rispetto alla profondità di messa a fuoco altera la chiarezza di immagine a causa della diffusione del fotone, che smussa i bordi degli oggetti di interesse. La realizzazione di una camera alta di 3 µm ridotto questo offuscamento laterale e fornito immagini eccezionalmente ben definita esclusione fluorescente anche utilizzando alta NA (0,8) 40 X obiettivi per visualizzare un neurone rami con elevata risoluzione laterale.
Chip di montaggio è un passo fondamentale, in particolare nel caso di 3 µm alta chambers, ma la manipolazione attenta come descritto al punto 4.1.2 evita il crollo del tetto. L’alta superficie in rapporto al volume associato a questi alloggiamenti sottili anche sollevato la questione della stabilità della concentrazione di destrano nel corso del tempo. Abbiamo controllato che l’assorbimento superficiale del destrano dopo una notte di incubazione era trascurabile: dopo la sostituzione del dextrano di PBS, la differenza di intensità tra il pilastro e lo sfondo era circa 1 / 1000 del contrasto tra intensità iniziale Queste due regioni in presenza di destrano. Si noti che i neuroni possono aderire il coprioggetto di fondo sia sul tetto PDMS. Questo effetto scomparirà quando usando fantasia coprioggetti (cioè quando noi non Incubare molecole adesive all’interno della camera PDMS), come il rivestimento è pertanto strettamente localizzato sul fondo della camera.
Oltre alla loro morfologia impegnativo, i neuroni sono piuttosto adatti a FXm dovuto al fatto che una delle principali limitazioni del metodo, cioè endocitosi di destrano, è molto limitata in queste cellule. Scegliamo un 10 kDa formulazione per sopprimere nel lungo intervallo (ore) eventuali fenomeni di endocitosi visibile.
In conclusione, la semplicità concettuale del FXm è bilanciata da un insieme di problemi sperimentali che sono stati risolti dal presente protocollo, ad esempio nanometriche PDMS rugosità e altezza della camera micrometrica o correzione del fondo per correggere le irregolarità del il soffitto di PDMS tra pilastri. Tuttavia, l’uso di una camera stretta microfluidici per confinare il mezzo fluorescente produce pochi vincoli specifici come la necessità di pilastri di sostegno, che abbassa la superficie efficace disponibile per adesione delle cellule, o la necessità di escludere soma dalla centrale Camera per osservare un neurone estensioni con la massima chiarezza, che limita le regioni della cellula accessibile all’osservazione ad alta risoluzione. Una possibile evoluzione di questo metodo sarebbe quello di sbarazzarsi di questo contenimento fisico, per essere sostituita da un ottico. Il nuovo sviluppo della microscopia foglio leggero potrebbe essere abbinato vantaggiosamente FXm in futuro.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vogliono riconoscere ChiLab, materiali e microsistemi laboratorio – Politecnico di Torino – DISAT, nella persona del Prof C F Pirri, Dr. M Cocuzza e Dr. S L Marasso, per il loro prezioso aiuto nel processo di sviluppo e fabbricazione di dispositivi. Ringraziamo Victor Racine da Quantacell di discussione e supporto nella elaborazione delle immagini. Siamo grati a Isabelle Grandjean e Manon Chartier da Animal Facility del Institut Curie per il loro sostegno per i topi e Pablo Vargas e Ana-Maria Lennon (Institut Curie) per averci fornito i topi GFP LifeAct. Siamo grati a Olivier Thouvenin dal Institut Langevin e Clotilde Cadart, Larisa Venkova e Matthieu Piel dall’Institut Curie – UMR 144, per il loro aiuto nella comprensione dell’esclusione fluorescenza metodo. Infine, ringraziamo la piattaforma tecnologica del Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) per il loro sostegno nella microfabbricazione. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dall’europeo ricerca Consiglio Advanced Grant No. 321107 “Violoncello”, Université PSL (progetto SwithNeuroTrails), ANR Investissement Avenir e la IPGG Labex ed Equipex.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |