אחסון הוא פרמטר חשוב לגבי מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של תאים. אנו מתארים שיטה הדרה פלורסנט ומאפשר מלא-שדה למדידה של במבחנה כמות עצביים עם תת מיקרומטר רזולוציה צירית הנדרש לניתוח של neurites ומבנים דינמי משתמעת בצמיחה עצביים.
אחסון הוא פרמטר חשוב לגבי מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים בפרקי זמן שונים. הנוירונים הם תאים די ייחודי ביחס שלהם מורפולוגיות כחוד המורחבת ולגדל כתוצאה מכך מספר אתגרים מתודולוגיים למדידה נפח. במקרה מסוים במבחנה הצמיחה עצביים, המתודולוגיה שבחרת צריך לכלול תת מיקרומטר רזולוציה צירית בשילוב עם שדה מלא התבוננות על פרקי זמן של דקות שעות או ימים. בניגוד לשיטות אחרות כמו תא צורה שחזור באמצעות הדמיה קונאפוקלית, מדידות מבוסס-חשמלית או מיקרוסקופ כוח אטומי, שיטת אי-הכללה של קרינה פלואורסצנטית שפותחו לאחרונה (FXm) יש פוטנציאל להגשים את האתגרים הללו. עם זאת, למרות פשוטים עקרונית שלה מימוש FXm ברזולוציה גבוהה עבור נוירונים דורש התאמות מרובות, מתודולוגיה ייעודי. אנו מציגים כאן שיטה המבוססת על השילוב של הדרה פלורסצנטיות, התקנים נמוכים-חספוס מרובה תאים microfluidic, ולבסוף micropatterning כדי להשיג במבחנה מדידות של אחסון מקומי עצביים. הרזולוציה הגבוהה שמספק המכשיר מותר לנו למדוד נפח מקומי של תהליכים עצביים (neurites), הנפח של כמה מבנים ספציפיים המעורבים צמיחה עצביים, כגון צמיחה קונוסים (Gc).
הידע המדויק של תאי האחסון משכה תשומת לב מוגברת בשנים האחרונות, מונע על ידי הנושא של הומאוסטזיס גודל תא מיקרואורגניזמים חד תאיות 1 , באופן כללי יותר תאים mitotic 2. אולם, השאלה של נפח התאים הוא רלוונטי גם עבור תאים mitotic פוסט, שעבורו נוירונים מהווים דוגמה פרדיגמטי.
נפח הוא אכן חתימה חשוב של אירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים סולמות שונים, בזמן נקודות בחיים עצביים, מ ארעית דפורמציה עצב משויך (סולם אלפיות השנייה) פעילות חשמלית 3 בלתי הפיך עצביים נפיחות המתרחשים במהלך השלב ללא תסמינים של ניווניות מחלות (השנים אצל בני אדם) 4. עם זאת, השינוי הגדול ביותר של אמצעי האחסון מתרחשת סרגל זמן ביניים של ימים או שבועות (תלוי האורגניזם נחשב) במהלך צמיחה עצביים. המורפולוגיה מורחבת ומורכבת של נוירונים מעלה בעיות כפולות, ביניהם ברגולציה של גודל התא. קוטר לאורכה עצב הם אכן בחוזקה מוסדר ויוו, עם ערכים ספציפיים לכל סוג עצביים 5,6.
סוגיות אלה, מורכבים כדי לטפל ויוו, ניתן לטפל גם באופן פשוט במבחנה. את השאיפה הזאת, שיטה המוקדש אמצעי מדידה מהר מספיק כדי לעקוב אחר הצמיחה דינמיקה (קרי בקנה מידה זמן של דקות) ועומד בקנה אחד עם תצפיות במשך שעות או ימים נדרש. מספר שיטות פותחו במהלך השנים כדי לספק גישה ישירה או עקיפה נפח סלולר בתוך חוץ גופית. תא שחזור של הדמיה קונאפוקלית הוא אחד מהם, אך לשיטה זו תהיה תיוג ו חוזרות חשיפות לאור תוך כדי הצגת רזולוציה צירית המוגבלת של ננומטר בערך 500 7. הערה מחסרונות האחרון שני אלה הם להתגבר חלקית על ידי שיטה מתוחכמת יותר, לאחרונה בשם סריג מיקרוסקופ אור-גיליון 8. מיקרוסקופ כוח אטומי כבר בשימוש 9 אבל זו שיטה סריקה היא תמצית מייגעת ואיטית. יתר על כן, הקשר גופניות שזה דורש עם התא עלול להפריע המדידה בהתחשב רכות קיצוני של נוירונים 10. יש כבר מועסקים שיטה עקיפה באמצעות אימפדנס או תהודה 11סוגי תאים שונים, אך לא מתאימות עבור מורחבות תאים דבק כמו נוירונים.
באחת השיטות המבטיחים ביותר מבוססת על מדידה של נפח אי-כלילה של תאים בתוך תא סגור מלא של הפלורסנט. שיטת אי-הכללה של קרינה פלואורסצנטית (FXm) היא פשוטה בעקרון שלו כפי שהוא דורש אין תיוג, מתאים הדמיה אופטית מהירה לטווח הארוך של אוכלוסיות תאים עם רזולוציה צירית פוטנציאל אופטי תת. ליתר דיוק, רזולוציית ב- z תלוי עוצמת קרינה פלואורסצנטית המרבית בחדר תרבות (כלומר באזור ללא תאים) מחולק הטווח הדינמי של המצלמה, למרות מספר מקורות רעש להגביל החלטה זו האולטימטיבי. שיטה זו כבר חזק מאוד לעקוב אחר כמות תאים חסיד נודדים 12 או ללמוד שינוי אמצעי במהלך מיטוזה בתרבית של תאים, כפי שמתואר באופן יסודי 13. עם זאת, נוירונים מהווה אתגר מתודולוגיים FXm בהתחשב שלהם השלכה נרחב לתוך תהליכים תת מיקרומטר.
אנו מציגים כאן שיטה המוביל הזיוף של צ’יימברס FXm חלקה כדי לגשת עם ברמת דיוק גבוהה עוצמת הקול וגובה של ענפים עצביים ומבנים דינמי מעורב צמיחה עצביים כמו קונוסים צמיחה.
צ’יימברס צריך לגבהים דומים יותר מהאובייקט למדוד כדי לייעל רזולוציה צירית. לכן, תיכננו התקנים FXm שונים, המאופיינת על ידי תאי המדידה המרכזי שלושה בגבהים שונים. הדק (3 מיקרומטר בגובה) מוקדש neurite מידה: גובה נמוך זה לא כולל סומא, שנשארים בתא ליד 15 מיקרומטר גבוהה ביניים. צ’יימברס מרכזי עבה (10 ו 12 מיקרומטר) גבוהים מספיק כדי לעקוב אחר הגידול התא כולו. המכשיר כולל גם שני מאגרים ממוקם משני צידי החדר המרכזי. הזרקת ארבעה חורים (IH) ובכך מיושמים, הן מוגדרות כדלקמן: כניסת ולשקע לשרת להציג את המתלים הסלולר לתוך השבב, ואילו שני האחרים להאכיל המאגרים.
. יש לנו הראשון coverslips כיול מפוברק למדידות גובה באמצעות מבנים photoresist של הגיאומטריה ידוע… לנו יש ואז צילמו נוירונים גדל ללא תשלום, אך גם מורפולוגית מאולצות נוירונים לתוך micropatterns של הידבקות.
אמצעי הדמיה של נוירונים, מהווה אתגר עבור הטכניקה FXm עקב בהרחבות ארוכים ודקים של תאים אלה. פרוטוקול זה מתאר גרסאות של אותו סוג של מכשיר microfluidic המוקדש נוירון הדמיה.
לצד ההיבטים של עיצוב microfluidic, הבחירה של המטרה הבסיסית עבור הדמיה הדרה פלורסצנטיות, מרמז על פשרה בין רוחבי ברזולוציה ובהירות תמונה. הוכח 13 כי נה גבוהה מוביל לעומק של המוקד קטן יותר מאשר הגובה קאמרית איננה מזיקה על הדיוק של מדידת נפח אם דימות בוצע לעבר המוקד ואם שוליים מספיק שנשאר בין קו המתאר של העצם של אני nterest, את גבולות השטח אינטגרציה. עם זאת, השימוש תא גבוהה בהרבה מזו העומק של המוקד פוגע בהירות התמונה עקב פוטון דיפוזיה, אשר מחליק קצוות האובייקטים של ריבית. הזיוף של תא מיקרומטר 3 גבוהה מופחתת טשטוש לרוחב וסיפק תמונות הדרה פלורסנט מוגדרת בצורה יוצאת דופן היטב אפילו באמצעות נה גבוהה (0.8) 40 X מטרות כדי להמחיש סניפים עצביים עם רזולוציה גבוהה לרוחב.
שבב בהרכבת הוא שלב קריטי, במיוחד במקרה של 3 מיקרומטר גבוהה צ’יימברס, אך זהיר מניפולציה כפי שמתואר 4.1.2 ימנע קריסת הגג. פני השטח גבוהה יחס נפח הקשורים ללשכה דק אלה העלה גם את סוגיית יציבות לתוספי ריכוז לאורך זמן. אנחנו בדקנו כי ספיגת לתוספי השטח אחרי לילה אחד של דגירה היה זניח: לאחר החלפת לתוספי על ידי PBS, ההבדל בעוצמה בין העמוד ואת הרקע היה כ 1 לכל 1000 של הניגוד העוצמה הראשונית בין שני אזורים אלה בנוכחות לתוספי. שימו לב כי נוירונים עשויים לדבוק על coverslip התחתון, וגם על הגג PDMS. אפקט זה נעלמת כאשר שימוש בדוגמת coverslips (כלומר כאשר אנו לא דגירה דבק מולקולות בתוך תא PDMS), הציפוי הוא לכן בקפדנות מקומי על החלק התחתון של החדר.
מלבד שלהם מורפולוגיה מאתגר, נוירונים הם די מתאימה כדי FXm בשל העובדה כי אחד המגבלה העיקרית של השיטה, כלומר לתוספי אנדוציטוזה, הוא מוגבל מאוד בתאים אלה. בחרנו 10 kDa ניסוח לדכא בטווח הארוך טווח (בשעות) כל התופעות אנדוציטוזה גלוי.
לסיכום, הפשטות הרעיוני של FXm מאוזנת על ידי קבוצת בעיות ניסיוני אשר נפתרו על ידי פרוטוקול הנוכחי, כגון החספוס PDMS nanometric, גובה קאמרית מיקרומטר, או רקע תיקון לתיקון לא שווה של התקרה PDMS בין העמודים. עם זאת, השימוש תא microfluidic קרוב להגבלת המדיום פלורסנט מניב מספר אילוצים ייחודיים כמו הצורך של עמודי תמיכה, אשר מוריד את השטח יעיל זמין עבור אדהזיה התא, או הצורך לשלול סומא המרכזי תא להתבונן הרחבות עצביים עם הבהירות הגבוהה, אשר מגביל את האזורים של התא נגיש תצפית ברזולוציה גבוהה. אבולוציה אפשרית אחת של שיטה זו יהיה להיפטר ההסגר הפיזי הזה, והוחלף על ידי. אדם אופטי. פיתוח חדש של מיקרוסקופ אור גיליון יכול להיות משולב ביתרון עם FXm בעתיד.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רצתה להכיר ChiLab, חומרים, מיקרוסיסטמס מעבדה – פוליטקניקו di טורינו – DISAT, בדמותו של פרופסור C F Pirri, ד ר מ’ Cocuzza, ד ר Marasso L S, על תמיכתם יקר ב תהליך פיתוח, ייצור המכשיר. אנו מודים ויקטור ראסין מ Quantacell לדיונים ותמיכה בעיבוד תמונה. אנו אסירי תודה איזבל Grandjean, מאנון Chartier מהמתקן חיה ובמכון קירי על תמיכתם של עכברים, ואת פבלו וורגאס לנון אנה-מריה (ובמכון קירי) סיפק לנו העכברים GFP LifeAct. אנו מודים על אוליבייה Thouvenin אינסטיטוט Langevin ו Cadart קלוטיד, לריסה Venkova, מתיו פיעל מ ובמכון קירי – UMR 144, על עזרתם בהבנה של הדרה פלורסצנטיות בשיטה. לבסוף, אנו מודים הפלטפורמה הטכנולוגית של אינסטיטוט פייר-ז’יל דה-ז’אן (CNRS הפותר המתמטי 3750) על תמיכתם במיקרו-מלאכותית. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי אירופה מחקר המועצה מתקדם מענק מס 321107 “צ’לו”, אוניברסיטת PSL (פרוייקט SwithNeuroTrails), d’Avenir ANR Investissement, ואת IPGG Labex Equipex.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |