Volume é um parâmetro importante sobre células características fisiológicas e patológicas. Nós descrevemos um método de exclusão fluorescente permitindo a medição de campo integral em vitro neuronal volume com sub micrométrica resolução axial, necessária para a análise de neuritos e estruturas dinâmicas implicadas em crescimento neuronal.
Volume é um parâmetro importante referentes às características fisiológicas e patológicas dos neurônios em escalas de tempo diferentes. Os neurônios são células bastante singular sobre suas morfologias ramificadas estendidas e consequentemente aumentar vários desafios metodológicos para a medição do volume. No caso particular de em vitro crescimento neuronal, a metodologia escolhida deve incluir a resolução axial sub micrométrica, combinada com a observação de campo integral em escalas de tempo de minutos a horas ou dias. Ao contrário de outros métodos, como a reconstrução de forma celular usando a imagem latente confocal, eletricamente com base em medições ou microscopia de força atômica, o método de exclusão de fluorescência recentemente desenvolvido (FXm) tem o potencial para atender a esses desafios. No entanto, apesar de ser simples em seu princípio, implementação de um FXm de alta resolução para os neurônios requer vários ajustes e uma metodologia dedicada. Apresentamos aqui um método baseado na combinação de exclusão de fluorescência, dispositivos microfluídicos de múltiplos compartimentos de baixa rugosidade e finalmente micropatterning para alcançar em vitro medições de volume neuronal local. A alta resolução fornecida pelo dispositivo nos permitiu medir o volume local de processos neuronais (neuritos) e o volume de algumas estruturas específicas envolvidas no crescimento neuronal, tais como cones de crescimento (GCs).
O conhecimento preciso do volume celular tem atraído maior atenção nos últimos anos, impulsionada pelo problema da homeostase de tamanho de célula em microorganismos unicelulares 1 e, mais geralmente, em células mitóticas 2. No entanto, a questão do volume das células é pertinente também para células pós mitóticas, para o qual os neurônios constituem um exemplo paradigmático.
Volume é de fato uma importante assinatura de eventos fisiológicos e patológicos em diferentes escalas e pontos de tempo na vida neuronal, da deformação de axonal transitória associada à atividade elétrica (escala de milissegundos) 3 para o irreversível neuronal inchaço ocorrendo durante a fase assintomática da Neurodegenerativas Doenças (ao longo de anos em humanos) 4. No entanto, a maior alteração de volume ocorre em uma escala de tempo intermediário de dias ou semanas (dependendo do organismo considerado) durante o crescimento neuronal. A prolongada e complexa morfologia de neurônios levanta questões de múltiplos, entre os quais a regulação do tamanho da célula. Diâmetro e comprimento axonal são na verdade firmemente regulado na vivo, com valores específicos para cada tipo neuronal 5,6.
Estas questões, complexos de abordar na vivo, também podem ser abordadas de uma forma simplificada in vitro. Com esse objetivo, um método dedicado à medição de volume rápido suficiente para acompanhar a dinâmica de crescimento (ou seja, em uma escala de tempo de minutos) e compatível com a observação ao longo de horas ou dias é necessária. Vários métodos têm sido desenvolvidos ao longo dos anos para proporcionar um acesso directo ou indirecto ao volume celular in vitro. Célula de reconstrução de imagem latente confocal é um deles, mas este método implica a rotulagem e repetidas exposições à luz ao mesmo tempo mostrando uma resolução axial limitada de cerca de 500 nm 7. Note que estes dois últimos inconvenientes são parcialmente superados por um método mais sofisticado e mais recente chamado retículo microscopia de luz-folha 8. Microscopia de força atômica tem sido usado 9 , mas este método de varredura é por essência lenta e tediosa. Além disso, o contato físico com a célula requer pode interferir com a medição Considerando a extrema suavidade dos neurônios 10. Método indireto usando impedância ou ressonância têm sido empregadas para 11tipos de célula diferente, mas são insuficientes para estendido adesivas células como os neurônios.
Um dos métodos mais promissores baseia-se na medida do volume excluído das células em uma câmara de perto com um corante fluorescente. O método de exclusão de fluorescência (FXm) é simples no seu princípio, pois requer sem rotulagem e é apropriado para a imagem latente ótica rápido, a longo prazo, de populações de células com uma resolução axial potencialmente sub óptica. Mais precisamente, a resolução em z depende da intensidade de fluorescência máxima na cultura câmara (ou seja, na região desprovida de células) dividida pela faixa dinâmica da câmera, embora várias fontes de ruído limitam esta resolução final. Este método tem sido muito poderoso a seguir o volume da migração de células aderentes 12 ou para estudar a mudança de volume durante a mitose de células de mamíferos, como exaustivamente descrito em 13. No entanto, os neurônios constituem um desafio metodológico para FXm considerando sua extensa ramificação em processos sub micrométricas.
Apresentamos aqui um método que conduz para a fabricação das câmaras de FXm suaves acesso com alta precisão o volume e altura de ramificações neuronais e estruturas dinâmicas envolvidas em crescimento neuronal, como cones de crescimento.
Câmaras devem ter alturas semelhantes que o objeto para medir a fim de otimizar a resolução axial. Portanto, nós projetamos dispositivos diferentes do FXm caracterizados por câmaras de medição central de três alturas diferentes. O mais fino (3 µm de altura) dedica-se à medição do axônio: esta baixa altura exclui a soma, que permanecem na próximo câmara intermediária alta 15 µm. Câmaras de centrais mais espessas (10 a 12 µm) são suficientemente altas para acompanhar o crescimento de células inteiras. O dispositivo também inclui dois reservatórios localizados em ambos os lados da câmara central. Quatro furos de injeção (IH), portanto, são implementados e são designados como segue: a entrada e saída servem para introduzir as suspensões celulares no chip, Considerando que os dois outros alimentam os reservatórios.
Temos a primeira calibração fabricados lamelas para medições de altura, usando estruturas de fotorresiste da geometria conhecida. Nós então ter fotografado livre neurônios crescentes, mas também morfologicamente restrito neurônios em micropatterns de adesão.
Imagem de volume de neurônios constitui um desafio para a técnica de FXm devido as longas e finas extensões dessas células. Este protocolo descreve as variantes do mesmo tipo de dispositivo microfluidic dedicado a imagem latente do neurônio.
Ao lado os aspectos do design microfluídicos, a escolha do objetivo é fundamental para a imagem latente de exclusão de fluorescência e implica um trade-off entre resolução lateral e a nitidez da imagem. Tem sido demonstrado em 13 que um at alta, levando a uma profundidade de foco menor do que a altura da câmara não foi prejudicial para a precisão de medição de volume se a imagem foi executada em foco e se é deixada uma margem suficiente entre o contorno do objeto de nterest e os limites da superfície de integração. No entanto, o uso de uma câmara muito maior do que a profundidade de foco prejudica a clareza de imagem devido à difusão de fótons, que suaviza as bordas dos objetos de interesse. A fabricação de uma câmara alta 3 µm reduzida a essa indefinição lateral e forneceu imagens de exclusão fluorescente excepcionalmente bem definidas mesmo usando alta at 40 (0,8) X objetivos Visualizar neuronais ramos com alta resolução lateral.
Chip de montagem é uma etapa crítica, em particular no caso de 3 µm câmaras altas, mas manipulação cuidadosa conforme descrito no ponto 4.1.2 evita o colapso do telhado. A superfície elevada à relação do volume associada a estas câmaras finas também levantou a questão da estabilidade da concentração de dextrano ao longo do tempo. Temos verificado que a superfície absorção do Dextran após uma noite de incubação foi insignificante: depois de substituir o Dextran pela PBS, a diferença de intensidade entre o pilar e o plano de fundo foi cerca de 1 por 1000 do contraste entre a intensidade inicial Estas duas regiões na presença de dextrano. Note-se que os neurônios podem aderir na lamela inferior e o telhado de PDMS. Este efeito desaparece quando usando estampadas lamelas (ou seja, quando nós não incubar adesivas moléculas dentro da câmara PDMS), como o revestimento, portanto, é estritamente localizado na parte inferior da câmara.
Além de sua morfologia desafiador, os neurônios são bastante adequados para FXm devido ao fato de que dentre a grande limitação do método, ou seja, endocitose de dextrano, é muito limitado nestas células. Nós escolhemos um 10 kDa formulação para suprimir a longo alcance (horas) qualquer fenômeno visível endocitose.
Em conclusão, a simplicidade conceitual do FXm é equilibrada por um conjunto de questões experimentais que foram resolvidos pelo presente protocolo, como nanométrica aspereza PDMS e altura de câmara micrométrica ou correcção de fundo para corrigir o desnível de o teto de PDMS entre pilares. No entanto, o uso de uma câmara estreita microfluidic confinar o meio fluorescente produz alguns condicionalismos específicos, como a necessidade de pilares de apoio, que reduz a superfície eficaz disponível para adesão celular, ou a necessidade de excluir a soma da central Câmara de observar neuronais extensões com a maior clareza, o que restringe as regiões da célula acessível à observação de alta resolução. Uma possível evolução desse método seria para se livrar deste confinamento físico, a ser substituído por um óptico. O novo desenvolvimento da microscopia de luz folha pode ser combinado vantajosamente com FXm no futuro.
The authors have nothing to disclose.
Os autores querem reconhecer ChiLab, materiais e laboratório Microsystems – Politecnico di Torino – DISAT, na pessoa do Prof C F Pirri, Dr. M Cocuzza e Dr. S L Marasso, pelo seu precioso apoio no processo de desenvolvimento e fabricação de dispositivo. Agradecemos Victor Racine de Quantacell para discussão e suporte no processamento de imagem. Estamos gratos a Isabelle Grandjean e Manon Chartier da instalação de Animal do Institut Curie para sua sustentação para os ratos e Pablo Vargas e Ana-Maria Lennon (Institut Curie) para nos fornecer com os ratos de GFP LifeAct. Estamos gratos à Olivier Thouvenin do Institut Langevin e Clotilde Cadart, Larisa Venkova e Matthieu Piel do Institut Curie – UMR 144, por sua ajuda na compreensão da exclusão da fluorescência método. Finalmente, agradecemos a plataforma tecnológica do Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) pelo seu apoio em microfabrication. Este trabalho foi financiado em parte pelo Europeu pesquisa Conselho Advanced Grant no. 321107 “Violoncelo”, Université de PSL (projeto SwithNeuroTrails), d’Avenir ANR Investissement e o Labex IPGG e Equipex.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |