Bu protokolün amacı, vestibüler schwannoma ve Schwann hücresi araştırmalarında birden fazla aşağı akım uygulaması için insan cerrahi numunelerinin toplanması ve işlenmesinin ana hatlarını vermektir.
Vestibüler schwannomalar, serebelopontin açıdaki en yaygın neoplazmlardır ve tüm intrakranyal büyümelerin% 6-8'ini oluştururlar. Bu tümörler, etkilenen bireylerin% 95'ine kadar sensörinöral işitme kaybına neden olsa da, işitme kaybının altında yatan moleküler mekanizmalar kaçınılmazdır. Bu makale, laboratuarımızda, vestibüler schwannomaların çalışmasına ayrık akışaşağı araştırma uygulamaları için çeşitli birincil insan dokusu örneklerinin toplanmasını ve işlenmesini kolaylaştırmak için kurulmuş olan adımları özetlemektedir. Özellikle, bu çalışma, cerrahi numunelerdeki Schwann ve schwannoma hücrelerinin toplanması, işlenmesi ve kültürü için birleşik bir metodolojik çerçeve tanımlamaktadır. Bu, şu anki araştırmalar için gerekli görülen paralel proses adımlarıyla bütünleşmiştir: tümör ve sinir salgılarının toplanması, RNA'nın korunması ve toplanan dokulardan protein ekstraksiyonu, bölümlerin hazırlanması için doku fiksasyonu,Primer insan hücrelerinin gen tedavisine uygulanması için adeno-ilişkili virüslere maruz kalması. Ek olarak, bu çalışma, bu tümörü, iç kulaktan ve perilymftten insan sensory epitelini elde etmek için eşsiz bir fırsat olarak toplamak için translabyrinthine cerrahi yaklaşımı vurgular. Deneysel kaliteyi artırmak için ipuçları sağlanmaktadır ve vurgulanılan yaygın tuzaklar bulunmaktadır.
Vestibüler schwannomalar (VS), her 100.000 kişiden 1 tanesinde serebellopontin açılarının en sık rastlanan neoplazmıdır. Metastatik olmamasına rağmen, bu tümörler bir hastanın yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Etkilenen kişiler genellikle işitme kaybı, kulak çınlaması ve işitme hissi ile yaşar. Belirtileri, tümör büyüdükçe denge sorunları, yüz felci ve diğer kraniyal sinir fonksiyonlarının bozulmasına yol açarak giderek zayıflamaya başlar. Beyin sapı kompresyonuna bağlı yaşamı tehdit eden komplikasyonlar da oluşabilir 7 .
VS için yönetim seçenekleri esasen statik tümörleri beklemek ve stereotaktik radyasyon tedavisi veya büyümekte olan tümörler için cerrahi rezeksiyon ile sınırlıdır <sUp class = "xref"> 8. Araştırmaya bağlı hastanelerde bu tümörlerin cerrahi olarak çıkarılması, hasta ameliyatları sırasında toplanan taze tümör dokusunu edinme ve analiz etme olanağı sunar. Translabirüsin rezeksiyonu olan, VS'ye spesifik bir cerrahi yaklaşım dahili kulaktan ve perilymfden değerli insan sensoryum epiteline ulaşmayı sağlayabilir.
VS'ler periferik bir duyu sinirinden ( yani, vestibüler sinir) kaynaklandığından VS ile ilişkili gözlemlerin, insan büyük auriküler sinir (GAN) gibi uygun bir kontrol sinirinden elde edilen gözlemlerle karşılaştırılması önemlidir. Sağlıklı GAN'lar parotidektomi veya boyun diseksiyonu sırasında düzenli olarak feda edilir ve sağlıklı Schwann hücre fizyolojisi için sağlam modeller olarak kullanılabilir 9 .
Sporadik VS'nin tedavisi veya önlenmesi için FDA onaylı herhangi bir ilaç bulunmadığından, araştırmacıların altta yatan moleküler meşeyi aydınlatması zorunludurTerapötik hedefleri belirlemek için hastalığın nismleri. VS patogenezinde rol oynadığı gösterilen proteinler merlin, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), siklooksigenaz 2 (COX-2), nükleer faktör kappa B (NF-κB), tümör nekroz faktör alfa (TNF-alfa) , Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve ilgili sinyal molekülleri olan 10,11,12,13,14,15,16,17 .
Yakın zamandaki ilerlemeler, birincil insan vestibüler schwannomaları ve sağlıklı sinir dokularının toplanması, işlenmesi, kültürü ve alt başlarında araştırılması için protokoller geliştirilmiş ve geliştirilmiş 18,19. Bununla birlikte, mevcut protokollerin çoğunun, preparatın( Örn . Tek başına hücre kültürü) için bu tür dokuların atılması. Bu makale, hücre tipi-spesifik kültür, protein ekstraksiyonu, RNA korunumu, tümör salgı toplama ve doku fiksasyonu gibi birçok alt akış uygulamaları için tek bir birincil insan VS veya GAN örneğinin aynı anda işlenmesi için birleşik bir metodolojik çerçeve sunmaktadır. Bu çalışma ayrıca, translabyrinthine VS reseksiyonu esnasında insan beyin-omurilik sıvısının (CSF) ve perilymfinin cerrahi olarak toplanması ve işlenmesi hakkında detaylı bilgi vermektedir, çünkü bu yakından ilişkili dokular VS için biyolojik belirteç kaynakları olarak hizmet edebilir. Sonunda, bu protokol, gen terapisinde kullanılmak üzere bu dokunun yeni bir uygulaması olan kültürdeki birincil insan VS hücrelerinin viral iletimi için adımlar sunmaktadır.
Bu el yazması, VS araştırması için birleştirilmiş bir metodolojik çerçeve tanımlamakta ve insan VS ve GAN numunelerinin akış aşağısı araştırma uygulamaları için eş zamanlı işlenmesini özetlemektedir. VS araştırması hassas tıbbın yapıldığı çağa girerken, aynı örneği çok sayıda araştırma sorusuna cevap verebilecek formlarda hazırlamak, bireysel hastalara özgü moleküler, hücresel, genetik ve proteomik görüşlerin keşfedilmesine olanak tanır.
İ…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DC015824 (KMS) ve T32DC00038 (JES ve SD'yi destekliyor), Savunma Bakanlığı hibe W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Vakfı (KMS) , Nancy Sayles Günü Vakfı (KMS), Lauer Tinnitus Araştırma Merkezi (KMS) ve Barnes Vakfı (KMS).
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |