המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר את אוסף ועיבוד של דגימות כירורגיות אנושיות עבור יישומים במורד הזרם רבים schwannoma שיווי המשקל מחקר שוואן התא.
Schwannomas שיווי המשקל הם neoplasms הנפוצים ביותר של זווית cerebellopontine, מה שהופך את 6-8% אחוז של כל גדיולים תוך גולגולתיים. למרות שגידולים אלה גורמים לאובדן שמיעה חושי עד ל -95% מהנפגעים, המנגנונים המולקולריים שבבסיס אובדן השמיעה נותרים חמקמקים. מאמר זה מתאר את הצעדים שנקבעו במעבדה שלנו כדי להקל על איסוף ועיבוד של דגימות רקמות אדם שונות עבור יישומים במורד הזרם מחקר אינטגרלי ללימוד שוואנומות שיווי המשקל. באופן ספציפי, עבודה זו מתארת מסגרת מתודולוגית אחידה לאיסוף, לעיבוד ולתרבות של שוואן ותאי שוואנומה מדגימות כירורגיות. זה משולב עם צעדים עיבוד מקבילים שנחשבים כיום חיוניים למחקר הנוכחי: אוסף של גידול הפרשות העצבים, שימור של רנ"א והפקת חלבון מ רקמות שנאספו, קיבוע של הרקמה להכנת סעיפים,ד את החשיפה של תאים אנושיים ראשוניים כדי adeno הקשורים וירוסים ליישום על טיפול גנטי. בנוסף לכך, עבודה זו מדגישה את הגישה התיראבינארית-כירורגית לאיסוף גידול זה כהזדמנות ייחודית להשגת אפיתל חושי אנושי מהאוזן הפנימית ומהפרילימף. טיפים לשיפור האיכות הניסיונית מסופקים ומלכודות נפוצות מודגשות.
שוונומות שיווי המשקל (VS) הן הנפוצים ביותר של זווית cerebellopontine, מאובחנים 1 בכל 100,000 אנשים. אם כי לא גרורות, גידולים אלה משפיעים קשות על איכות החיים של המטופל 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . אנשים נפגעים בדרך כלל לחיות עם אובדן שמיעה, טינטון, ותחושה של מלאות aural. התסמינים הופכים יותר ויותר מתישים ככל הגידול גדל, גרימת בעיות איזון, שיתוק בפנים, ואת הליקוי של תפקודים עצביים גולגולתיים אחרים. סיבוכים מסכני חיים עקב דחיסת גזע המוח עשויים גם להתרחש 7 .
אפשרויות ניהול עבור VS מוגבלים בעיקר ממתין מחכה לגידולים סטטיים ו הקרנות סטריאוטקטיות או כריתה כירורגית לגידול גידולים <sUp class = "xref"> 8. הסרה כירורגית של גידולים אלה בבתי חולים המזוהים עם מחקר מציעה הזדמנות לרכוש ולנתח רקמות סרטניות חדשות שנאספו במהלך ניתוחים לחולים. גישה כירורגית ספציפית ל VS, הניתוח של translabyrinthine, יכולה אף להציע גישה לאפיתל סנסורי אנושי חשוב מהאוזן הפנימית ומהפרילימף.
מכיוון ש – VSs נובעים מעצב חושי היקפי ( כלומר, עצב שיווי המשקל), חשוב להשוות בין תצפיות הקשורות ל – VS לבין אלו הנובעות מעצב בקרה מתאים, כגון עצב האאוריקולרי האנושי (GAN). גנים בריאים הם מקריבים באופן קבוע במהלך parotidectomies או חתכים הצוואר והוא יכול לשמש מודלים חזקים לבריאות פיזיולוגית התא Schwann 9 .
מאחר שאין תרופות המאושרות על ידי ה- FDA לטיפול או למניעת VS סדיר, חיוני שחוקרים יבהירו את המולה המולקולרית הבסיסיתNisms של המחלה כדי לזהות מטרות טיפוליות. חלבונים אשר הוכיחו כי הם ממלאים תפקיד בפתוגנזה של VS כוללים את המארלין, גורם הגדילה האנדותל של כלי הדם (VEGF), cyclooxygenase 2 (COX-2), גורם גרעיני kappa B (NF-κB), גורם נמק בגידול אלפא (TNF-alpha) , קולטן גורם גדילה של אפידרמיס (EGFR), ומולקולות איתות קשורות 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
ההתקדמות האחרונות הרחיבו ושיפרו פרוטוקולים לאיסוף, עיבוד, תרבות, ומחקר במורד הזרם של schwannomas וסטיבולרי ראשוני האדם ורקמות עצב בריא 18 , 19 . עם זאת, רוב הפרוטוקולים הקיימים נועדו להתאים את הכנהAtion של רקמות כאלה עבור יישום מחקר במורד אחד ( כלומר, תרבות התא לבד). מאמר זה מציג מסגרת מתודולוגית מאוחדת לעיבוד סימולטני של מדגם VS ראשוני יחיד או מדגם GAN ליישומים רבים במורד הזרם: סוג תא ספציפי תרבות, מיצוי חלבונים, שימור רנ"א, אוסף הפרשת הגידול וקיבוע רקמות. עבודה זו גם מפרטת את האוסף הכירורגי ואת העיבוד של נוזל המוח השדרה האנושי (CSF) ו perlymph במהלך כריתת VSS translanabyrinthine, כמו אלה רקמות הקשורות קשר הדוק עשוי לשמש מקורות חשובים של סמנים ביולוגיים עבור VS. לבסוף, פרוטוקול זה מציג שלבים התמרה ויראלי של תאים VS האדם העיקרי בתרבות כמו יישום חדשני של רקמה זו לשימוש בטיפול גנטי.
כתב יד זה מתאר מסגרת מתודולוגית אחידה למחקר VS, המתאר את העיבוד בו-זמני של דגימות VS ו- GAN אנושיים עבור יישומי מחקר במורד הזרם. כאשר מחקר VS נכנס לרפואה מדויקת, הכנת המדגם אותו בצורות המסוגלות לענות על שאלות מחקר רבות תאפשר גילוי של תובנות מולקולריות, תאיות, גנטיות ופרוטומ…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של חירשות הפרעות תקשורת אחרות מעניקה R01DC015824 (KMS) ו T32DC00038 (תמיכה JES ו SD), משרד הביטחון מענק W81XWH-14-1-0091 (KMS), קרן ברטרלי (KMS) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), מרכז המחקר לאואר טיניטוס (KMS) וקרן בארנס (KMS).
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |