O objetivo deste protocolo é descrever a coleta e processamento de amostras cirúrgicas humanas para múltiplas aplicações a jusante no schwannoma vestibular e na pesquisa de células de Schwann.
Os schwannomas vestibulares são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, constituindo 6-8% de todos os crescimentos intracranianos. Embora esses tumores causem perda auditiva neurossensorial em até 95% dos indivíduos afetados, os mecanismos moleculares subjacentes a essa perda auditiva permanecem indescritíveis. Este artigo descreve as etapas estabelecidas em nosso laboratório para facilitar a coleta e processamento de várias amostras primárias de tecido humano para aplicações de pesquisa a jusante integrantes ao estudo de schwannomas vestibulares. Especificamente, este trabalho descreve um quadro metodológico unificado para a coleta, processamento e cultura de células de Schwann e Schwannoma a partir de amostras cirúrgicas. Isso é integrado a etapas de processamento paralelo, agora consideradas essenciais para a pesquisa atual: a coleta de secreções tumorais e nervosas, a preservação do RNA e a extração de proteínas dos tecidos coletados, a fixação do tecido para a preparação de seções, umaD a exposição de células humanas primárias a vírus adeno-associados para aplicação na terapia genética. Além disso, este trabalho destaca a abordagem cirúrgica translocrítica para colecionar este tumor como uma oportunidade única para obter o epitélio sensorial humano da orelha interna e perilimia. São fornecidas dicas para melhorar a qualidade experimental e destacadas armadilhas comuns.
Os schwannomas vestibulares (VSs) são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, diagnosticadas em 1 em cada 100.000 indivíduos. Embora não metastáticos, esses tumores afetam gravemente a qualidade de vida de um paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Indivíduos afetados geralmente vivem com perda auditiva, zumbido e um sentimento de plenitude auditiva. Os sintomas tornam-se cada vez mais debilitantes à medida que o tumor cresce, causando problemas de equilíbrio, paralisia facial e comprometimento de outras funções do nervo craniano. Complicações potencialmente fatais devido à compressão do tronco encefálico também podem ocorrer 7 .
As opções de gerenciamento de VS são essencialmente limitadas à espera atenta de tumores estáticos e terapia de radiação estereotáxica ou ressecção cirúrgica para tumores em crescimento <sUp class = "xref"> 8. A remoção cirúrgica destes tumores em hospitais afiliados à pesquisa apresenta a oportunidade de adquirir e analisar o tecido tumoral fresco coletado durante as cirurgias do paciente. Uma abordagem cirúrgica específica para VS, a ressecção translaberina, pode mesmo oferecer acesso a um epitélio sensorial humano valioso da orelha interna e perilimia.
Como os VS provêm de um nervo sensorial periférico ( ou seja, o nervo vestibular), é importante comparar as observações associadas ao VS com as derivadas de um nervo de controle apropriado, como o grande nervo auricular humano (GAN). GANs saudáveis são regularmente sacrificados durante a parotidectomia ou dissecção do pescoço e podem ser usados como modelos robustos para a fisiologia das células de Schwann saudáveis 9 .
Como não há medicamentos aprovados pela FDA para o tratamento ou prevenção de VS esporádicos, é imperativo que os pesquisadores elucidem o mecanismo molecular subjacenteNismos da doença para identificar alvos terapêuticos. As proteínas que demonstraram desempenhar um papel na patogênese VS incluem merlin, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenase 2 (COX-2), fator nuclear kappa B (NF-kB), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) , Receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e moléculas de sinalização relacionadas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Avanços recentes expandiram e melhoraram os protocolos para a coleta, processamento, cultura e investigação a jusante de schwannomas vestibulares humanos primários e tecidos nervosos saudáveis 18 , 19 . No entanto, a maioria dos protocolos existentes são projetados para acomodar a preparaçãoDe tais tecidos para um único pedido de pesquisa a jusante ( isto é, cultura celular sozinho). Este artigo apresenta um quadro metodológico unificado para o processamento simultâneo de uma única amostra humana primária VS ou GAN para múltiplas aplicações a jusante: cultura específica do tipo celular, extração de proteínas, preservação de ARN, coleta de secreção de tumor e fixação de tecido. Este trabalho também detalha a coleta e processamento cirúrgico do líquido cefalorraquidiano (CSF) humano e perilymph durante a ressecção VS translabyrintin, uma vez que estes tecidos intimamente relacionados podem servir como fontes importantes de biomarcadores para VS. Finalmente, este protocolo apresenta etapas para a transdução viral de células VS humanas primárias em cultura como uma nova aplicação deste tecido para uso na terapia de genes.
Este manuscrito descreve um quadro metodológico unificado para pesquisas VS, descrevendo o processamento simultâneo de espécimes humanos VS e GAN para aplicações de pesquisa a jusante. À medida que a pesquisa VS entra na idade da medicina de precisão, preparar a mesma amostra em formas capazes de responder a inúmeras questões de pesquisa possibilitará a descoberta de informações moleculares, celulares, genéticas e proteômicas específicas para pacientes individuais.
A pureza da…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo RIEDC015824 (KMS) e T32DC00038 (apoiando JES e SD), o Departamento de Defesa concede W81XWH-14-1-0091 (KMS), a Fundação Bertarelli (KMS) , A Fundação Nancy Sayles Day (KMS), o Centro de Pesquisa Lauer Tinnitus (KMS) e a Fundação Barnes (KMS).
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |