Un cadre méthodologique unifié pour la recherche sur le schwannome vestibulaire
Summary
Le but de ce protocole est de décrire la collecte et le traitement des échantillons chirurgicaux humains pour de multiples applications en aval dans le schwannome vestibulaire et la recherche de cellules Schwann.
Abstract
Les schwannomes vestibulaires sont les néoplasmes les plus courants de l'angle de la cerebellopontine, ce qui représente 6 à 8% de toutes les croissance intracrânienne. Bien que ces tumeurs provoquent une perte auditive sensiveureure chez 95% des personnes affectées, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cette perte auditive demeurent insaisissables. Cet article décrit les étapes établies dans notre laboratoire pour faciliter la collecte et le traitement de divers échantillons primaires de tissus humains pour les applications de recherche en aval intégrées à l'étude des schwannomes vestibulaires. Plus précisément, ce travail décrit un cadre méthodologique unifié pour la collecte, le traitement et la culture des cellules Schwann et Schwannoma à partir d'échantillons chirurgicaux. Ceci est intégré aux étapes de traitement en parallèle, maintenant considérées comme essentielles pour la recherche actuelle: la collecte des sécrétions tumorales et nerveuses, la préservation de l'ARN et l'extraction des protéines des tissus collectés, la fixation du tissu pour la préparation des sections,D l'exposition des cellules humaines primaires aux virus adéno-associés pour l'application à la thérapie génique. En outre, ce travail met en évidence l'approche chirurgicale translymérine pour collecter cette tumeur comme une occasion unique d'obtenir l'épithélium sensoriel humain de l'oreille interne et de la périlymph. Des conseils pour améliorer la qualité expérimentale sont fournis et les pièges courants sont mis en évidence.
Introduction
Les schwannomes vestibulaires (VS) sont les néoplasmes les plus fréquents de l'angle de la cerebellopontine, diagnostiqués chez 1 sur 100 000 individus. Bien que non métastatiques, ces tumeurs affectent sévèrement la qualité de vie du patient 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Les personnes touchées vivent généralement avec une perte auditive, un acouphène et un sentiment de plénitude auditive. Les symptômes deviennent de plus en plus débilitants à mesure que la tumeur augmente, provoquant des problèmes d'équilibre, une paralysie faciale et une altération d'autres fonctions du nerf crânien. Des complications potentiellement mortelles dus à la compression du tronc cérébral peuvent également entraîner 7 .
Les options de gestion des VS sont essentiellement limitées à l'attente vigilante de tumeurs statiques et de radiothérapie stéréotaxique ou de résection chirurgicale pour les tumeurs croissantes <sUp class = "xref"> 8. L'élimination chirurgicale de ces tumeurs dans les hôpitaux affiliés à la recherche présente l'opportunité d'acquérir et d'analyser le tissu tumoral frais recueilli lors des chirurgies du patient. Une approche chirurgicale spécifique de VS, la résection de translabérine, peut même offrir un accès à l'épithélium sensoriel humain précieux de l'oreille interne et du périlymph.
Parce que les VS proviennent d'un nerf sensoriel périphérique ( c.-à-d. Le nerf vestibulaire), il est important de comparer les observations associées aux VS avec celles issues d'un nerf témoin approprié, comme le nerf auriculaire humain (GAN) humain. Les GAN sains sont régulièrement sacrifiés lors de la parotidectomie ou des dissections cervicales et peuvent être utilisés comme modèles robustes pour la physiologie des cellules Schwann saines 9 .
Étant donné qu'il n'y a pas de médicaments approuvés par la FDA pour le traitement ou la prévention de VS sporadiques, il est impératif que les chercheurs élucient les mécanismes moléculaires sous-jacentsNismes de la maladie pour identifier les cibles thérapeutiques. Les protéines qui ont montré qu'ils jouent un rôle dans la pathogenèse VS comprennent le Merlin, le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), la cyclooxygénase 2 (COX-2), le facteur nucléaire kappa B (NF-κB), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) , Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), et les molécules de signalisation connexes 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Des avancées récentes ont élargi et amélioré les protocoles pour la collecte, le traitement, la culture et l'étude en aval des schwannomes vestibulaires humains primaires et des tissus nerveux sains 18 , 19 . Cependant, la plupart des protocoles existants sont conçus pour accueillir la préparationDe ces tissus pour une seule demande de recherche en aval ( c.- à-d. Culture cellulaire seule). Cet article présente un cadre méthodologique unifié pour le traitement simultané d'un seul échantillon VS ou GAN humain primaire pour de multiples applications en aval: culture spécifique au type de cellule, extraction de protéines, préservation de l'ARN, collecte de la sécrétion tumorale et fixation des tissus. Ce travail décrit également la collecte et le traitement chirurgicaux du liquide céphalo-rachidien humain (CSF) et du perilymph lors de la résection VS de translabyrinthine, car ces tissus étroitement apparentés peuvent servir de sources importantes de biomarqueurs pour VS. Enfin, ce protocole présente des étapes pour la transduction virale de cellules VS humaines primaires en culture comme une nouvelle application de ce tissu pour une utilisation en thérapie génique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit décrit un cadre méthodologique unifié pour la recherche VS, décrivant le traitement simultané de spécimens humain VS et GAN pour les applications de recherche en aval. À mesure que la recherche VS entre dans l'âge de la médecine de précision, la préparation du même échantillon sous des formes capables de répondre à de nombreuses questions de recherche permettra la découverte d'idées moléculaires, cellulaires, génétiques et protéomiques spécifiques aux patients individuels.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions du Département national de la surdité et des autres troubles de la communication R01DC015824 (KMS) et T32DC00038 (en soutenant JES et SD), le ministère de la Défense accorde W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fondation Bertarelli (KMS) , La Nancy Sayles Day Foundation (KMS), le Lauer Tinnitus Research Center (KMS) et la Fondation Barnes (KMS).
Materials
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
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