Цель этого протокола состоит в том, чтобы наметить сбор и обработку человеческих хирургических образцов для нескольких нисходящих приложений в вестибулярной шванноме и исследованиях клеток Шванна.
Вестибулярные шванномы являются наиболее распространенными новообразованиями угла мозжечка, составляя 6-8% всех интракраниальных ростков. Хотя эти опухоли вызывают сенсорную потерю слуха у 95% пациентов, молекулярные механизмы, лежащие в основе этой потери слуха, остаются неуловимыми. В этой статье описываются этапы, установленные в нашей лаборатории для облегчения сбора и обработки различных первичных образцов тканей человека для последующих исследований, интегральных для изучения вестибулярных шванномов. В частности, эта работа описывает унифицированную методологическую основу для сбора, обработки и культивирования клеток Шванна и шванномы из хирургических образцов. Это интегрировано с параллельными этапами обработки, которые сейчас считаются необходимыми для текущих исследований: сбор опухолей и нервных секретов, сохранение РНК и экстракция белка из собранных тканей, фиксация ткани для подготовки секций,D воздействие первичных клеток человека на адено-ассоциированные вирусы для применения в генной терапии. Кроме того, в этой работе подчеркивается трансбрабиринтный хирургический подход, чтобы собрать эту опухоль как уникальную возможность получить сенсорный эпителий человека из внутреннего уха и перилимфа. Предусмотрены советы по улучшению качества эксперимента и выделены общие проблемы.
Vestibular schwannomas (VS) являются наиболее распространенными новообразованиями угла мозжечка, диагностированными в 1 из каждых 100 000 особей. Хотя они и не являются метастатическими, эти опухоли серьезно влияют на качество жизни пациента 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Пострадавшие люди обычно живут с потерей слуха, тиннитусом и чувством слуховой полноты. Симптомы становятся все более истощающими, когда опухоль растет, вызывая проблемы с балансом, лицевой паралич и ухудшение функций других черепных нервов. Также могут возникнуть опасные для жизни осложнения, связанные с компрессией мозга.
Варианты управления для ВС в основном ограничены внимательным ожиданием статических опухолей и стереотаксической лучевой терапии или хирургической резекцией для роста опухолей <sUp class = "xref"> 8. Хирургическое удаление этих опухолей в научно-исследовательских больницах дает возможность приобретать и анализировать свежую опухолевую ткань, собранную во время операций пациента. Один конкретный хирургический подход к ВС, трансабиринтная резекция, может даже предложить доступ к ценному человеческому сенсорному эпителию из внутреннего уха и перилимфа.
Поскольку VS возникают из периферического сенсорного нерва ( т. Е. Вестибулярного нерва), важно сравнить VS-ассоциированные наблюдения с данными, полученными из соответствующего контрольного нерва, например, у человека с большим аурикулярным нервом (GAN). Здоровые ГАН регулярно жертвуют при паротидэктомии или диссекции шеи и могут использоваться в качестве надежных моделей для здоровой физиологии клеток Шванна 9 .
Поскольку нет лекарств, одобренных FDA для лечения или профилактики спорадических ВС, крайне важно, чтобы исследователи выяснили основные молекулярные мехиЧтобы определить терапевтические цели. Белки, которые, как было показано, играют роль в патогенезе VS, включают в себя мерлин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), циклооксигеназу 2 (COX-2), ядерный фактор каппа B (NF-κB), фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа) , Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и связанные сигнальные молекулы 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Недавние достижения расширили и улучшили протоколы сбора, обработки, культивирования и последующего исследования первичных вестибулярных шванномов человека и здоровых нервных тканей 18 , 19 . Однако большинство существующих протоколов предназначены для( Например, только клеточная культура). В этой статье представлена унифицированная методологическая основа для одновременной обработки одного первичного человеческого VS или образца GAN для нескольких последующих приложений: клеточная специфическая культура, экстракция белка, сохранение РНК, сбор опухолевых секретов и фиксация тканей. В этой работе также подробно описывается хирургический сбор и обработка спинномозговой жидкости человека (CSF) и перилимф во время трансабиринтной VS-резекции, поскольку эти тесно связанные ткани могут служить важными источниками биомаркеров для VS. Наконец, этот протокол представляет собой шаги для вирусной трансдукции первичных человеческих VS-клеток в культуре в качестве нового применения этой ткани для использования в генной терапии.
В этой рукописи описывается унифицированная методологическая основа исследования VS, в которой описывается одновременная обработка образцов VS и GAN человека для последующих исследований. Поскольку исследование VS входит в эпоху прецизионной медицины, подготовка одного и того же образц…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным институтом глухоты и других расстройств связи грантов R01DC015824 (KMS) и T32DC00038 (поддержка JES и SD), грант Министерства обороны W81XWH-14-1-0091 (KMS), Фонд Bertarelli (KMS) , Фонд Нэнси Сэйлса (KMS), Исследовательский центр Lauer Tinnitus Research (KMS) и Фонд Барнса (KMS).
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |