Un quadro metodologico unificato per la ricerca di Schwannoma Vestibolare
Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare la raccolta e l'elaborazione di campioni chirurgici umani per molteplici applicazioni a valle nello schwannoma vestibolare e nella ricerca delle cellule di Schwann.
Abstract
Gli schwannomi vestibolari sono le neoplasie più comuni dell'angolo cerebellopotintico, che costituiscono il 6-8% per cento di tutte le crescite intracraniche. Sebbene questi tumori causino perdita uditiva sensa-neurale fino al 95% degli individui affetti, i meccanismi molecolari che sottendono questa perdita dell'udito rimangono inaspettati. Questo articolo delinea i passi stabiliti nel nostro laboratorio per facilitare la raccolta e l'elaborazione di vari campioni di tessuto umano primario per applicazioni di ricerca a valle integrate nello studio degli schwannomi vestibolari. In particolare, questo lavoro descrive un quadro metodologico unificato per la raccolta, l'elaborazione e la coltura di Schwann e schwannoma da campioni chirurgici. Questo è integrato con processi di elaborazione parallela ora considerati essenziali per la ricerca attuale: la raccolta di secrezioni tumorali e nervose, la conservazione dell'RNA e l'estrazione di proteine dai tessuti raccolti, la fissazione del tessuto per la preparazione di sezioni,D l'esposizione delle cellule umane primarie ai virus adeno-associati per l'applicazione alla terapia genica. Inoltre, questo lavoro mette in evidenza l'approccio chirurgico traslabellinoso per raccogliere questo tumore come un'occasione unica per ottenere l'epitelio umano sensoriale dall'orecchio e dalla periferia. Sono forniti suggerimenti per migliorare la qualità sperimentale e mettere in evidenza metodi comuni.
Introduction
Gli schwannomi vestibolari (VSs) sono le neoplasie più comuni dell'angolo del cerebellopotina, diagnosticate in 1 ogni 100.000 individui. Anche se non metastatici, questi tumori influenzano gravemente la qualità della vita di un paziente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Gli individui affetti abitualmente vivono con perdita dell'udito, tinnito e una sensazione di pienezza ascoltale. I sintomi diventano sempre più debilitanti quando il tumore cresce, causando problemi di equilibrio, paralisi facciale e alterazioni delle altre funzioni del nervo cranico. Anche le complicazioni pericolose per la vita a causa della compressione del tronco cerebrale possono avere luogo 7 .
Le opzioni di gestione per VS sono essenzialmente limitate all'attesa vigile di tumori statici e terapia radioterapica stereotattica o resezione chirurgica per tumori in crescita <sUp class = "xref"> 8. La rimozione chirurgica di questi tumori negli ospedali affiliati alla ricerca presenta l'opportunità di acquisire e analizzare i tessuti freschi del tumore raccolti durante interventi di pazienti. Un approccio chirurgico specifico alla VS, la resezione translabellinale, può anche offrire l'accesso a preziosi epitelio umano sensoriale dall'orecchio e dalla periferia.
Poiché VS provengono da un nervo sensoriale periferico ( vale a dire il nervo vestibolare), è importante confrontare le osservazioni associate a VS con quelle derivate da un appropriato nervo di controllo, come il grande nervo auricolare umano (GAN). GANs sani vengono sacrificati regolarmente durante le parotidectomie o le dissezioni del collo e possono essere utilizzate come modelli robusti per una fisiologia sana di Schwann 9 .
Poiché non esistono farmaci approvati dalla FDA per il trattamento o la prevenzione di VS sporadiche, è indispensabile che i ricercatori illustrano la mecha molecolare sottostanteGli effetti della malattia per identificare i bersagli terapeutici. Le proteine che hanno dimostrato di avere un ruolo nella patogenesi della VS includono il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), la cicloossigenasi 2 (COX-2), il fattore nucleare kappa B (NF-κB), il fattore di necrosi tumorale (TNF-alfa) , Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e le relative molecole di segnalazione 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
I progressi recenti hanno ampliato e migliorato i protocolli per la raccolta, l'elaborazione, la cultura e l'analisi a valle degli schwannomi vestibolari umani primari e dei tessuti nervosi sani 18 , 19 . Tuttavia, la maggior parte dei protocolli esistenti sono progettati per ospitare la preparazioneZione di tali tessuti per un'unica applicazione di ricerca a valle ( vale a dire, solo la coltura cellulare). Questo articolo presenta un quadro metodologico unificato per l'elaborazione simultanea di un singolo campione primario umano VS o GAN per più applicazioni a valle: cultura specifica di tipo cellulare, estrazione proteica, conservazione RNA, raccolta della secrezione tumorale e fissazione tissutale. Questo lavoro illustra anche la raccolta chirurgica e l'elaborazione del fluido cerebrospinale umano (CSF) e della periliazione durante la resezione transcirculinata VS, in quanto questi tessuti strettamente correlati possono servire come fonti importanti di biomarcatori per VS. Infine, questo protocollo presenta passi per la trasduzione virale delle cellule VS umane primarie nella coltura come nuova applicazione di questo tessuto per l'uso nella terapia genica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto descrive un quadro metodologico unificato per la ricerca VS, che descrive la lavorazione simultanea di esemplari di VS e GAN umani per applicazioni di ricerca a valle. Poiché la ricerca VS entra nell'epoca della medicina di precisione, preparando lo stesso campione in forme in grado di rispondere a numerose domande di ricerca, consentirà la scoperta di visioni molecolari, cellulari, genetiche e proteomiche specifiche per singoli pazienti.
La purezza della cellula uma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (sostenendo JES e SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) , La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS), il Centro di ricerca del tinnito di Lauer (KMS) e la Fondazione Barnes (KMS).
Materials
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma?. Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma?. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
