Платформа анти-биопленки Assays Подходят к исследованию природных библиотек Compound
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
Биоплёнки считаются одним из самых сложных тем современной биомедицины, и они потенциально ответственны за более чем 80% к антибиотикам терпимы инфекций. Биоплёнки проявили исключительно высокую толерантность к химиотерапии, который, как считается многофакторным. Например, матрица обеспечивает физический барьер, который уменьшает проникновение антибиотиков в биопленку. Кроме того, клетки внутри биопленки фенотипически разнообразны. Вероятно, биопленки устойчивость возникает из сочетания этих и других, еще неизвестных, механизмов. Все из ныне существующих антибиотиков были разработаны против одноядерные клетки (планктонных) бактерий. Таким образом, до сих пор, очень ограниченный репертуар молекул существует, которые могут избирательно воздействовать на зрелых биопленок. Эта ситуация привела прогрессивный сдвиг парадигмы в обнаружении наркотиков, в котором поиск по анти-биопленки было призвано занять более видное место. Дополнительной проблемой является то, что естьочень ограниченное число стандартизованных методов исследования биопленок, особенно те, которые могут быть использованы для большого скрининга химических библиотек. Здесь, экспериментальный анти-биопленки платформа для химического скрининга представлена. Он использует три пробы для определения жизнеспособности биопленки (с резазурин окрашивания), общая биомасса (с кристаллическим фиолетовым окрашиванием) и биопленки матрицу ( с использованием зародышей пшеницы агглютинин, WGA-флуоресценция на основе окрашивание поли N -он-глюкозамина, PNAG , доля). Все анализы были разработаны с использованием золотистого стафилококка в качестве модельных бактерий. Примеры того, как платформа может быть использована для первичного скрининга, а также для функциональной характеристике выявленных анти-биопленки попаданий представлены. Эта экспериментальная последовательность дополнительно позволяет классификации обращений на основе измеренных конечных точек. Она также предоставляет информацию об их способе действия, особенно на долгосрочной перспективе по сравнению с краткосрочным химиотерапевтических эффектов. Таким образом, это очень Advantageous для быстрой идентификации высококачественных хитовых соединений, которые могут служить в качестве отправной точки для различных биомедицинских применений.
Introduction
Бактерии могут переключаться между двумя очень разными образа жизни, планктонных и сидячие, из которых биопленки является наиболее распространенным примером. В биопленок, бактерии образуют структурированные сообщества , внедренные в собственного производства матрицы 1. Это собственного производства матрица представляет собой барьер между бактериями и их внешней среды, и он защищает микробные клетки, держа их в непосредственной близости. Состав матрицы биопленки изменяется между и даже в пределах вида, но он в основном состоит из тугой сети липополисахаридов, внеклеточную ДНК и белков. Матрица служит в качестве физического барьера , ингибирующего вход вредных агентов, но оно также защищает биопленки от обезвоживания и предотвращает питательные вещества от выхода из клетки 2.
Биоплёнки считаются одним из самых сложных тем современной биомедицины, и они якобы ответственны за более чем 80% к антибиотикам терпимы инфекций 3. Они Индик.точкилежал по своей природе высокую устойчивость от внешних угроз: влажности, осмотическое давление, механическое напряжение 4, тепла, УФ – излучения 5, дезинфицирующие средства, антимикробные агенты, и иммунная система 1 хозяин. Например, требуемая концентрация противомикробного агента требуется, чтобы убить биопленку было показано, что в 1000 раз выше по сравнению с, что требуется, чтобы убить бактерии планктонные. Объяснение этому более высокой толерантности, кажется, многофакторный. Матрица представляет собой физический барьер, который уменьшает проникновение антибиотиков в биопленку. Кроме того, клетки внутри биопленки фенотипически разнообразны; они переходят между различными метаболическими состояниями из – за существующего градиента кислорода, питательных веществ и метаболитов между внутренней и наружной частями биопленки 6. Следовательно, в некоторых биопленки регионах, таких как ядро, бактерии лишены кислорода и питательных веществ, и живут в метаболически менее активными или полностью неактивном состоянии <suр> 7. Полностью покоящихся упоминаются как стойкая бактерия клеток, и они не восприимчивы к традиционным антимикробным лечения 8. Таким образом, вполне вероятно, что биопленка устойчивость возникает из комбинации в настоящее время предложены и другие, еще не известные механизмы. Staphylococcus SPP. прежнему относятся к числу наиболее проблемных грамположительных бактерий, вызывая серьезные, часто биопленки , связанные с инфекциями, 4. Предполагается , что до 99% всех бактерий связаны внутри биопленок, что делает его преобладающим бактериальный образ жизни 3. Тем не менее, все из ныне существующих антибиотиков были разработаны против одноклеточных (планктонных) бактерий. До сих пор очень ограниченный репертуар молекул существует, которые могут избирательно воздействовать на зрелых биопленок. Эта ситуация привела прогрессивный сдвиг парадигмы в обнаружении наркотиков, в котором поиск по анти-биопленки было призвано занять более видное место.
Из methodologскую перспективу, существуют дополнительные проблемы, так как только ограниченное число методов биопленки были разработаны организациями по установлению стандартов, особенно те, которые применяются к высокопроизводительного скрининга химических библиотек. Все стандартные анализы (с одним лишь исключением) основаны на биопленки реакторов, и эти методы требуют больших рабочих объемов и большое количество соединений, подлежащих испытанию, которые, как правило недоступны на ранней стадии исследуемым 9-12. Единственный существующий стандартизированный скрининг-тест применяется является так называемый Калгари биопленки устройств, из которых коммерчески доступные системы минимальной биопленки устранения концентрации (MBEC) была разработана 13-15. Однако ограничение этого анализа является то, что биопленки выращивают на колышками, а не все виды бактерий или даже штаммы в пределах одного вида, способны образовывать биопленки на этом устройстве. Кроме того, методы, которые могут быть особенно применительно к исследованию природных соединенийнеобходимо. Натуральные продукты были основным источником инноваций в области антимикробной обнаружения наркотиков в течение прошлого столетия 16. Они могут предложить новые анти-биопленки соединений с уникальными механизмами действия, которые также могут быть эффективными против стойкая бактерия клеток. Таким образом, исследование природных и, естественно, вдохновленных библиотек имеет высокие шансы на производство перспективных и уникальных анти-биопленки ведет.
Здесь мы представляем экспериментальные детали платформы анализов , который был разработан для химического скрининга анти-биопленки соединений с использованием трех анализов для измерения влияния на жизнеспособность, общей биомассы, а также матрицы золотистого стафилококка биопленок. Первый тест измеряет жизнеспособность биопленки, и она основана на резазурин окрашивания. Ресазурина является окислительно-восстановительный краситель, который является синим и нефлуоресцирующего в окисленном состоянии и превращается в розовый, сильно флуоресцирующего ресоруфина когда уменьшается на метаболическую активность бактерий. Это очень простой и быстрый меню подходит для первичного скрининга 17-20. Второй анализ, основанный на кристаллическим фиолетовым окрашиванием, измеряет суммарную массу биопленки. Кристаллвиолетом является широко используемым пятном для изучения бактерий и бактерий в биопленки 19,21-23. Анализ основан на недорогих реагентов и имеет простую измеряющий оптическую плотность конечной точки. И, наконец, третий анализ нацелен на внеклеточный полимерное вещество (EPS) -матрица биопленки через агглютинина зародышей пшеницы (WGA), который специфически связывается с поли N – Ацетил-глюкозамин остатков (PNAG) , присутствующие в матрице стафилококковых биопленок 24. WGA конъюгирован с флуорофором , которые могут быть обнаружены с помощью читателей интенсивности флуоресценции 25. Мы приведем здесь обоснование и детали платформы мы разработали, включая примеры приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Там нет ни одного метода, который может одновременно измерить эффект соединения на жизнеспособность, биомассы и биопленки матрицы. Таким образом, существует необходимость для объединения анализов с целью выявления эффекта на трех конечных точек, предпочтительно на стадии первичного …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят профессора Пола Cos и LMPH, Университет Антверпена, Бельгия за его поддержку во время съемочного процесса в своей лаборатории. Эта работа была профинансирована Академии проектов Финляндии (проекты 272266 и 282981) и Svenska Tekniska Vetenskapsakademien я Финляндия. Технические вклады MSc Джанни Kujala признаны.
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
