Une plate-forme de dosages anti-biofilm Adaptés à l'exploration des bibliothèques de composés naturels

Summary

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Abstract

Les biofilms sont considérés comme l'un des sujets les plus difficiles de la biomédecine moderne, et ils sont potentiellement responsables de plus de 80% des infections aux antibiotiques tolérantes. Les biofilms ont fait preuve d'une tolérance exceptionnelle pour la chimiothérapie, qui est considérée comme multifactorielle. Par exemple, la matrice constitue une barrière physique qui diminue la pénétration des antibiotiques dans le biofilm. En outre, les cellules au sein des biofilms sont phénotypiquement diverses. Probablement, biofilm résilience résulte d'une combinaison de ceux-ci et d'autres mécanismes, encore inconnus,. Tous les antibiotiques actuellement existants ont été mis au point contre les cellules-simples (planctoniques) bactéries. Par conséquent, jusqu'à présent, un répertoire très limité de molécules existe qui peut agir sélectivement sur les biofilms matures. Cette situation a entraîné un changement de paradigme progressiste dans la découverte de médicaments, dans laquelle rechercher les anti-biofilms a été invité à occuper une place plus importante. Un défi supplémentaire est qu'il yanombre de méthodes normalisées pour la recherche de biofilm, en particulier ceux qui peuvent être utilisés pour le criblage à grande débit de banques chimiques très limitée. Ici, une plate-forme anti-biofilm expérimentale pour le dépistage chimique est présenté. Coloration de la N – acétyl-glucosamine poly- PNAG base WGA-fluorescence , il utilise trois essais pour mesurer biofilm viabilité (avec résazurine coloration), la biomasse totale (avec coloration au cristal violet) et la matrice du film biologique ( en utilisant une agglutinine de germe de blé, , fraction). Tous les dosages ont été développés en utilisant Staphylococcus aureus que les bactéries du modèle. Des exemples de la façon dont la plate-forme peut être utilisée pour le criblage primaire, ainsi que pour la caractérisation fonctionnelle des résultats anti-biofilm identifiés sont présentés. Cette séquence expérimentale permet en outre la classification des résultats sur la base des points finaux mesurés. Il fournit également des informations sur leur mode d'action, en particulier sur le long terme par rapport aux effets chimiothérapeutiques à court terme. Par conséquent, il est très avantageous pour l'identification rapide des composés à succès de haute qualité qui peuvent servir de point de départ pour diverses applications biomédicales.

Introduction

Les bactéries peuvent basculer entre les deux modes de vie très différents, planctoniques et sessiles, dont un biofilm est l'exemple le plus commun. En biofilms, les bactéries forment des communautés structurées noyées dans une matrice auto-produit ^1. Cette matrice auto-produit est une barrière entre les bactéries et leur environnement extérieur, et il protège les cellules microbiennes, en les gardant à proximité. La composition de la matrice du biofilm varie entre et au sein même espèce, mais il est principalement constitué d'un réseau serré de lipopolysaccharides, de l'ADN extracellulaire, et des protéines. La matrice sert de barrière physique , l' inhibition de l'entrée d'agents nocifs, mais protège également le biofilm de la déshydratation et empêche les nutriments de fuite de la cellule ^2.

Les biofilms sont considérés comme l' un des sujets les plus difficiles de la biomédecine moderne, et ils sont prétendument responsables de plus de 80% des infections aux antibiotiques tolérantes ^3. Ils DISPétablir une tolérance intrinsèquement élevée contre les menaces extérieures: l' humidité, la pression osmotique, stress mécanique ^4, chaleur, rayonnement UV ^5, désinfectants, agents antimicrobiens, et le système immunitaire de l' hôte ^1. Par exemple, la concentration en agent antimicrobien requis nécessaire pour tuer un biofilm a été montré que jusqu'à 1000 fois plus élevée par rapport à celle requise pour tuer les bactéries planctoniques. L'explication de cette plus grande tolérance semble être multifactorielle. La matrice constitue une barrière physique qui diminue la pénétration des antibiotiques dans le biofilm. En outre, les cellules au sein des biofilms sont phénotypiquement divers; leur transition entre les différents états métaboliques dus à un gradient existant de l' oxygène, des substances nutritives et des métabolites entre les parties intérieure et extérieure du biofilm ^6. Par conséquent, dans certaines régions du biofilm, comme le noyau, les bactéries sont privées d'oxygène et de nutriments et vivent dans un métaboliquement moins actif ou un état complètement dormantes <sup> 7. Les cellules complètement inactives sont désignées comme cellules persister, et ils ne sont pas sensibles aux traitements antibiotiques conventionnels ^8. Par conséquent, il est probable que la résistance biofilm résulte d'une combinaison des mécanismes actuellement proposés et d'autres, encore inconnus. Staphylococcus spp. sont encore parmi les bactéries les gram-positives les plus problématiques, ce qui provoque de graves, souvent liés à biofilm, les infections ^4. Il est suggéré que jusqu'à 99% de toutes les bactéries sont associées au sein de biofilms, ce qui rend la vie bactérienne prédominante ^3. Cependant, tous les antibiotiques actuellement existants ont été développés contre une seule cellule (planctoniques) bactéries. Jusqu'à présent, un répertoire très limité de molécules existe qui peut sélectivement agir sur les biofilms matures. Cette situation a entraîné un changement de paradigme progressiste dans la découverte de médicaments, dans laquelle rechercher les anti-biofilms a été invité à occuper une place plus importante.

D'un méthodologperspective ical, des défis supplémentaires existent, car seul un nombre limité de méthodes de biofilm ont été développés par des organisations de normalisation, en particulier celles qui sont applicables au criblage à haut débit de banques chimiques. Tous les tests standardisés (avec une seule exception) sont basées sur des réacteurs biofilm, et ces méthodes nécessitent d' importants volumes de travail et de grandes quantités de composés à tester, qui sont généralement indisponibles pendant la phase d' investigation précoce ^9-12. Le dosage de criblage standard applicable seulement existant est le soi-disant dispositif de Calgary biofilm, à partir de laquelle le système disponible dans le commerce de concentration de l' élimination du biofilm minimale (MBEC) est développé ^13-15. Cependant, la limitation de ce test est que les biofilms sont cultivées sur des piquets, et non pas toutes les espèces bactériennes ou même des souches de la même espèce sont capables de former des biofilms sur cet appareil. En outre, les méthodes qui peuvent être particulièrement appliqués à l'exploration de composés naturels sontnécessaire. Les produits naturels ont été la principale source d'innovation dans la découverte de médicaments antimicrobiens au cours du siècle ^16. Ils peuvent fournir des composés anti-biofilm nouveaux avec des mécanismes d'action uniques qui peuvent aussi être efficaces contre les cellules Persister. Ainsi, l'exploration des bibliothèques naturelles et d'inspiration naturelle a de fortes chances de produire des pistes anti-biofilm prometteurs et uniques.

Ici, nous présentons les détails expérimentaux d'une plate – forme d'essais qui a été développé pour le criblage chimique des composés anti-biofilm utilisant trois essais pour mesurer les effets sur la viabilité, la biomasse totale, et de la matrice de biofilms Staphylococcus aureus. Le premier essai mesure biofilm viabilité et elle est basée sur la coloration résazurine. La résazurine est un colorant d'oxydo-réduction qui est bleu et non fluorescent dans son état oxydé et se transforme en rose de la résorufine, fortement fluorescent lorsqu'il est réduit par l'activité métabolique des bactéries. Il est un m très simple et rapideéthode appropriée pour des projections primaires ^17-20. Le deuxième essai, sur la base de coloration au cristal violet, mesure la masse de biofilm totale. Le cristal violet est une tache largement utilisée pour étudier les bactéries et les bactéries dans les biofilms ^19,21-23. L'essai est basé sur des réactifs peu coûteux et a une lecture simple absorbance final. Enfin, le troisième test cible la substance polymérique extracellulaire (EPS) -MATRIX du biofilm au moyen d' agglutinine de germe de blé (WGA), qui se lie spécifiquement au poly- résidus de N – acétyl-glucosamine (PNAG) présents dans la matrice du biofilm ²⁴ staphylocoques. WGA est conjugué à un fluorophore qui peut être détectée en utilisant des lecteurs d'intensité de fluorescence ^25. Nous présentons ici les raisons et les détails de la plate-forme que nous avons développé, y compris des exemples d'applications.

Protocol

1. Faire croître les bactéries Pré-culture les bactéries durant la nuit dans un bouillon de soja tryptique (TSB) à 37 ° C avec 220 rpm agitation (16-18 h). Diluer la pré-culture 100-1,000 fois ( en fonction du taux des bactéries de croissance; ici, 1000 fois est utilisé pour S. aureus) dans l' eau douce du BST et de le laisser grandir à 37 ° C et 200 tours par minute pour atteindre une croissance exponentielle (optique densité à 595 nm (DO 595) entre 0,2 et 0,6)….

Representative Results

Dans la plate-forme proposée, les effets sur la viabilité, la biomasse et de la matrice du biofilm sont quantifiés. Dans la séquence de travail (figure 1), une plaque d'échantillon est coloré avec résazurine et ensuite avec du cristal violet pour évaluer simultanément les effets sur la viabilité des bactéries de biofilm et sur la biomasse totale du biofilm. Les deux tests peuvent être réalisés consécutivement dans la même plaque , car il a été démo…

Discussion

Il n'y a pas de méthode unique qui peut simultanément mesurer l'effet d'un composé sur la viabilité, la biomasse, et de la matrice de biofilm. Par conséquent, il est nécessaire de combiner des tests pour détecter un effet sur les trois points d'extrémité, de préférence à une étape de criblage primaire.

La résazurine est un protocole de coloration très simple ne comportant que de l'addition de la sonde redox. Cependant, l'établissement du temps d'in…

Materials

Resazurin	Sigma Aldrich	R7017
Crystal violet	Sigma Aldrich	HT90132
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	W11261
LIVE/DEAD BacLight	Molecular Probes	L7012	SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red
Phosphate Buffered Saline
Tryptone soy agar	Lab M, Neogen	LAB011
Tryptine soy broth	Lab M, Neogen	LAB004
F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom	Thermo Fisher Scientific	161093
BRAND caps, strips of 8	Sigma Aldrich	BR781413-300EA
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769428-1EA
Multipipette	Thermo Fisher Scientific
Multidrop dispenser	Thermo Fisher Scientific
Biomek 3000	Beckman Coulter
Varioskan Flash Multiplate reader	Thermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureus	ATCC	25923