ومنصة للفحوصات مكافحة بيوفيلم مناسبة لاستكشاف المكتبات مركب طبيعي
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
وتعتبر الأغشية الحيوية باعتبارها واحدة من أكثر الموضوعات الصعبة المتمثلة في الطب الحيوي الحديث، وأنها هي المسؤولة عن أكثر من 80٪ من حالات العدوى للمضادات الحيوية متسامحة يحتمل. وقد عرض الأغشية الحيوية والتسامح عالية بشكل استثنائي للعلاج الكيميائي، والتي يعتقد أن تكون سياقاتها. على سبيل المثال، توفر مصفوفة حاجز مادي أن يقلل من تغلغل المضادات الحيوية في بيوفيلم. أيضا، وخلايا داخل الأغشية الحيوية متنوعة ظاهريا. على الأرجح، تنشأ بيوفيلم مرونة من مزيج من هذه وغيرها من الآليات، غير معروف حتى الآن. وقد وضعت كل من المضادات الحيوية الموجودة حاليا ضد خلايا واحدة (العوالق) البكتيريا. لذلك، حتى الآن، ذخيرة محدود جدا من جزيئات موجودة التي يمكن أن تعمل بشكل انتقائي على الأغشية الحيوية ناضجة. وقد أدى هذا الوضع تحولا تدريجيا في اكتشاف المخدرات، الذي تم حث البحث عن معاداة الأغشية الحيوية لتحتل مكانا أكثر بروزا. تحديا إضافيا هو أن هناكعدد من أساليب موحدة للبحوث بيوفيلم، وخاصة تلك التي يمكن أن تستخدم لفحص-إنتاجية كبيرة من المكتبات الكيميائية محدودة للغاية. هنا، يتم تقديم منصة لمكافحة بيوفيلم تجريبية لفحص الكيميائي. تلطيخ ويستخدم ثلاثة فحوصات لقياس قابلية بيوفيلم (مع تلطيخ ريسازورين)، إجمالي الكتلة الحيوية (مع تلطيخ الكريستال البنفسجي)، ومصفوفة بيوفيلم (باستخدام راصة جنين القمح، استنادا WGA مضان للبولي N -acetyl الجلوكوزامين، PNAG ، جزء). وقد وضعت جميع المقايسات باستخدام المكورات العنقودية الذهبية حيث تكون البكتيريا نموذج. وقدم أمثلة لكيفية منصة يمكن استخدامها لغربلة أولية فضلا عن التوصيف الوظيفي ليضرب المضادة للبيوفيلم التي تم تحديدها. يسمح هذا التسلسل التجريبي كذلك إلى تصنيف يضرب استنادا إلى نهاية نقاط قياس. كما يوفر معلومات عن طريقة عملها، وخصوصا على المدى الطويل مقابل آثار العلاج الكيميائي على المدى القصير. وبالتالي، فمن أدفا جداntageous لسرعة تحديد المركبات ضرب عالية الجودة التي يمكن أن تكون نقطة لانطلاق لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية.
Introduction
يمكن للبكتيريا التبديل بين اثنين من أنماط الحياة المختلفة جدا، العوالق واطئة، منها بيوفيلم هو المثال الأكثر شيوعا. في الأغشية الحيوية، والبكتيريا تشكل المجتمعات تنظيما جزءا لا يتجزأ من الذات المنتجة مصفوفة 1. هذه المصفوفة الذات المنتجة هي الحاجز بين البكتيريا والبيئة الخارجية، وأنه يحمي الخلايا الميكروبية، وحفظ لهم على مقربة. تكوين مصفوفة بيوفيلم يختلف بين وحتى داخل الأنواع، ولكنها تتكون في معظمها من شبكة محكمة من عديدات سكر شحمية، والحمض النووي خارج الخلية، والبروتينات. تخدم مصفوفة بمثابة حاجز مادي يحول دون دخول عوامل ضارة، ولكنه يحمي أيضا بيوفيلم من الجفاف وتمنع المواد المغذية من الهرب الخلية 2.
وتعتبر الأغشية الحيوية باعتبارها واحدة من أكثر الموضوعات الصعبة المتمثلة في الطب الحيوي الحديث، وأنها هي المسؤولة يزعم لأكثر من 80٪ من حالات العدوى للمضادات الحيوية متسامحة 3. أنها يمكن التخلصوضع والتسامح عالية بطبيعتها ضد التهديدات الخارجية: الرطوبة والضغط الاسموزي، إجهاد 4، الحرارة، الأشعة فوق البنفسجية 5 والمطهرات والعوامل المضادة للجراثيم، والمضيف نظام المناعة 1. على سبيل المثال، فقد تبين أن تركيز عامل مضاد للميكروبات المطلوبة اللازمة لقتل بيوفيلم إلى أن تكون أعلى ما يصل إلى 1،000 مرات في مقارنة إلى ما هو مطلوب لقتل البكتيريا العوالق. يبدو أن تفسير لهذا التسامح العالي ليكون سياقاتها. وتقدم المصفوفة حاجز مادي أن يقلل من تغلغل المضادات الحيوية في بيوفيلم. أيضا، وخلايا داخل الأغشية الحيوية متنوعة ظاهريا. انتقالهم بين الدول الأيض المختلفة بسبب الانحدار الحالية من الأكسجين والمغذيات، والأيض بين الأجزاء الداخلية والخارجية للبيوفيلم 6. وبالتالي، في بعض المناطق بيوفيلم، مثل القلب، ويحرمون البكتيريا من الأوكسجين والمواد المغذية والعيش في أقل نشاطا أيضي أو حالة سبات تماما <suص> 7. ويشار إلى خلايا نائمة تماما إلى الخلايا كما persister، وأنها ليست عرضة للعلاجات المضادة للميكروبات التقليدية 8. وبالتالي، فمن المرجح أن بيوفيلم مرونة تنشأ من مجموعة من الآليات المقترحة حاليا وغيرها، غير معروف حتى الآن. المكورات النيابة. لا تزال من بين البكتيريا إيجابية الجرام الأكثر إشكالية، مما تسبب شديدة، غالبا ما ترتبط بيوفيلم، الالتهابات 4. ويشار إلى أن ما يصل إلى 99٪ من كل البكتيريا ترتبط داخل الأغشية الحيوية، مما يجعل من نمط الحياة البكتيرية الغالبة 3. ومع ذلك، فقد وضعت كل من المضادات الحيوية الموجودة حاليا ضد وحيدة الخلية (العوالق) البكتيريا. وحتى الآن، ذخيرة محدود جدا من جزيئات موجودة التي يمكن أن تعمل بشكل انتقائي على الأغشية الحيوية ناضجة. وقد أدى هذا الوضع تحولا تدريجيا في اكتشاف المخدرات، الذي تم حث البحث عن معاداة الأغشية الحيوية لتحتل مكانا أكثر بروزا.
من منهجيهمنظور كال، تحديات إضافية موجودة، كما لم توضع إلا لعدد محدود من وسائل بيوفيلم من قبل منظمات وضع المعايير، وخاصة تلك التي تنطبق على فحص عالية الإنتاجية من المكتبات الكيميائية. وتستند جميع المقايسات الموحدة (مع استثناء واحد فقط) على المفاعلات بيوفيلم، وهذه الأساليب تتطلب كميات عاملة كبيرة وكميات كبيرة من المركبات لفحصها، والتي عادة ما تكون غير متوفرة أثناء مرحلة الفحص المبكر 9-12. وموحد فحص الفرز ينطبق إلا الحالية هو ما يسمى جهاز كالجاري بيوفيلم، والتي وضعت المتوفرة تجاريا الحد الأدنى بيوفيلم القضاء على تركيز (MBEC) نظام 13-15. ومع ذلك، فإن الحد من هذا الاختبار هو أن الأغشية الحيوية تزرع على أوتاد، وليس كل الأنواع البكتيرية أو حتى سلالات داخل نفس النوع قادرون على تشكيل الأغشية الحيوية على هذا الجهاز. وعلاوة على ذلك، الأساليب التي يمكن تطبيقها بشكل خاص لاستكشاف المركبات الطبيعيةبحاجة. وكانت منتجات الطبيعية مصدرا رئيسيا للابتكار في اكتشاف الأدوية المضادة للميكروبات خلال القرن الماضي 16. أنها يمكن أن توفر مركبات جديدة لمكافحة بيوفيلم مع آليات فريدة من الإجراءات التي يمكن أيضا أن تكون فعالة ضد خلايا persister. وهكذا، واستكشاف المكتبات الطبيعية ومستوحاة بشكل طبيعي لديها فرص كبيرة لإنتاج الخيوط واعدة وفريدة من نوعها لمكافحة بيوفيلم.
هنا، نقدم تفاصيل التجريبية من منصة المقايسات التي تم تطويرها لفحص المواد الكيميائية من المركبات المضادة للبيوفيلم باستخدام ثلاثة فحوصات لقياس الآثار المترتبة على قدرتها على البقاء، إجمالي الكتلة الحيوية، ومصفوفة الأغشية الحيوية المكورات العنقودية الذهبية. الفحص الأول يقيس قابلية بيوفيلم، ويستند على تلطيخ ريسازورين. ريسازورين هو وصمة عار الأكسدة التي هي الأزرق وغير الفلورسنت في حالته تتأكسد وتتحول إلى اللون الوردي، resorufin الفلورسنت للغاية عندما خفضت من النشاط الأيضي للبكتيريا. وهو م بسيط جدا وسريعethod مناسبة للعروض الأولية 17-20. الفحص الثاني، على أساس الكريستال البنفسجي تلطيخ، ويقيس مجموع كتلة بيوفيلم. الكريستال البنفسجي هو وصمة عار استخداما لدراسة البكتيريا والبكتيريا في الأغشية الحيوية 19،21-23. ويستند هذا الفحص على الكواشف غير مكلفة ولها بسيطة القراءة الامتصاصية نقطة النهاية. وأخيرا، وفحص ثالث يستهدف مادة البوليمر (EPS) -matrix خارج الخلية من بيوفيلم عبر راصة جنين القمح (WGA)، الذي يربط خصيصا لبولي N مخلفات -acetyl الجلوكوزامين (PNAG) الموجودة في مصفوفة من الأغشية الحيوية العنقوديات 24. ويضاف إلى WGA مع fluorophore التي يمكن الكشف عنها باستخدام القراء كثافة مضان 25. نقدم هنا المنطق وتفاصيل منصة وضعنا، بما في ذلك أمثلة من التطبيقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
ليس هناك طريقة واحدة يمكن أن تقيس وقت واحد تأثير مركب على الجدوى، والكتلة الحيوية، ومصفوفة بيوفيلم. لذلك، هناك حاجة للجمع بين فحوصات من أجل الكشف عن تأثير على النهاية ثلاثة، ويفضل أن يكون في مرحلة الفرز الأولية.
ريسازورين هو بروت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر الأستاذ بول كوس وLMPH، جامعة أنتويرب، بلجيكا لدعمه أثناء عملية التصوير في مختبره. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل أكاديمية مشاريع فنلندا (مشاريع 272266 و282981) وسفنسكا TEKNISKA Vetenskapsakademien ط فنلندا. واعترف المساهمات الفنية للماجستير Janni Kujala.
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
