Eine Plattform von Assays Anti-Biofilm auf die Erforschung der natürlichen Substanzbibliotheken Geeignet
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
Biofilme sind als eines der schwierigsten Themen der modernen Biomedizin angesehen, und sie sind möglicherweise verantwortlich für über 80% der Antibiotika-tolerante Infektionen. Biofilme haben eine außerordentlich hohe Toleranz für die Chemotherapie angezeigt, die multifaktoriell zu sein gedacht wird. Zum Beispiel stellt die Matrix eine physikalische Barriere, die das Eindringen von Antibiotika in den Biofilm abnimmt. Auch Zellen innerhalb der Biofilme sind phänotypisch vielfältig. Wahrscheinlich entsteht Biofilm Elastizität aus einer Kombination von diesen und anderen, noch unbekannte Mechanismen. Alle derzeit bestehenden Antibiotika gegen Single-Zellen (Plankton) Bakterien entwickelt worden. Daher Bisher existiert ein sehr begrenztes Repertoire von Molekülen, die selektiv auf reife Biofilme wirken kann. Diese Situation hat sich eine progressive Paradigmenwechsel in der Arzneimittelforschung getrieben, in denen Orten für die Anti-Biofilm gedrängt wurde eine prominentere Stelle zu besetzen. Eine weitere Herausforderung ist, dass es eine gibtsehr begrenzte Anzahl von standardisierten Verfahren zur Biofilmforschung, insbesondere diejenigen, die für große Durchsatzscreening von chemischen Bibliotheken verwendet werden können. Hier wird ein experimentelles anti-Biofilm-Plattform für chemisches Screening vorgestellt. Es nutzt drei Assays Biofilm Lebensfähigkeit (mit Resazurin – Färbung), Gesamtbiomasse (mit Kristallviolett – Färbung) und Biofilmmatrix (unter Verwendung eines Weizenkeimagglutinin, WGA-Fluoreszenz-basierte Färbung der Poly- N – Acetyl-Glucosamin zu messen, PNAG Fraktion). Alle Tests wurden unter Verwendung von Staphylococcus aureus als Modell Bakterien entwickelt. Beispiele dafür, wie die Plattform für die primäre Screening verwendet werden sowie für die funktionelle Charakterisierung von identifizierten anti-Biofilm Treffer vorgestellt. Diese experimentelle Sequenz ermöglicht ferner die Klassifizierung der Basis Treffer auf den gemessenen Endpunkte. Es bietet auch Informationen über ihre Wirkungsweise, vor allem auf langfristige gegen kurzfristige chemotherapeutischen Effekte. Somit ist es sehr advantageous für die schnelle Identifizierung von qualitativ hochwertigen Hit-Verbindungen, die als Ausgangspunkte für verschiedene biomedizinische Anwendungen dienen kann.
Introduction
Bakterien können sich zwischen zwei sehr unterschiedlichen Lebensstile wechseln, planktonischen und sessilen, von denen ein Biofilm das häufigste Beispiel ist. In Biofilmen bilden Bakterien strukturierte Gemeinschaften in einem selbstproduzierten eingebettete Matrix 1. Diese selbst hergestellten Matrix ist eine Barriere zwischen den Bakterien und ihrer äußeren Umgebung und schützt die mikrobiellen Zellen, so dass sie in unmittelbarer Nähe zu halten. Die Zusammensetzung der Biofilmmatrix variiert zwischen und sogar innerhalb der Arten, aber es besteht hauptsächlich aus einem engen Netz von Lipopolysacchariden, extrazelluläre DNA und Proteinen. Die Matrix dient als physikalische Barriere das Eindringen von schädlichen Substanzen inhibierende, aber es schützt auch die Biofilm vor Austrocknung und verhindert Nährstoffe entweicht der Zelle 2.
Biofilme sind als eines der schwierigsten Themen der modernen Biomedizin angesehen, und sie sind angeblich verantwortlich für über 80% der Antibiotika-tolerante Infektionen 3. Sie displag ein von Natur aus eine hohe Toleranz gegen äußere Bedrohungen: Feuchtigkeit, den osmotischen Druck, mechanische Beanspruchung 4, Hitze, UV – Strahlung 5, Desinfektionsmittel, antimikrobielle Mittel, und das Immunsystem des Wirts 1. Zum Beispiel für die erforderliche antimikrobielle Mittel Konzentration einen Biofilm zu töten wurde im Vergleich zu der erforderlich ist, um zu töten Planktonbakterien bis zu 1000-mal höher erwiesen. Die Erklärung für diese höhere Toleranz scheint multifaktoriell zu sein. Die Matrix stellt eine physikalische Barriere, die das Eindringen von Antibiotika in den Biofilm abnimmt. Auch Zellen innerhalb der Biofilme sind phänotypisch vielfältig; sie Übergang zwischen verschiedenen metabolischen Zuständen aufgrund eines vorhandenen Gradienten von Sauerstoff, Nährstoffen und Stoffwechselprodukten zwischen den inneren und äußeren Teilen des Biofilms 6. Daher wird in einigen Biofilm Regionen, wie der Kern, sind Bakterien der Sauerstoff entzogen und Nährstoffe und leben in einer metabolisch weniger aktive oder einem völlig ruhenden Zustand <sup> 7. Die vollständig ruhenden Zellen werden als persister Zellen bezeichnet, und sie sind nicht empfindlich gegenüber konventionellen antimikrobiellen Behandlungen 8. Somit ist es wahrscheinlich, dass Biofilm Elastizität aus einer Kombination der gegenwärtig vorgeschlagenen und andere entsteht, noch unbekannte Mechanismen. Staphylococcus spp. sind immer noch zu den problematischen grampositiven Bakterien, was zu schweren, oft Biofilm bezogenen, 4 – Infektionen. Es wird vorgeschlagen , dass bis zu 99% aller Bakterien in Biofilmen verbunden sind, es der vorherrschende bakterielle Lebens 3 macht. Jedoch sind alle der derzeit vorhandenen Antibiotika sind gegen einzellige (planktonischen) Bakterien entwickelt. Bisher ein sehr begrenztes Repertoire von Molekülen besteht, die selektiv auf reife Biofilme wirken kann. Diese Situation hat sich eine progressive Paradigmenwechsel in der Arzneimittelforschung getrieben, in denen Orten für die Anti-Biofilm gedrängt wurde eine prominentere Stelle zu besetzen.
Aus methodologische Perspektive, zusätzliche Herausforderungen bestehen, da nur eine begrenzte Anzahl von Biofilmverfahren durch Normungsorganisationen entwickelt wurden, vor allem diejenigen, die für das Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken. Alle standardisierten Assays (mit einer Ausnahme) basieren auf Biofilmreaktoren, und diese Verfahren erfordern große Arbeitsvolumina und große Mengen von Verbindungen getestet werden, die während der frühen Untersuchungsstadium 9-12 Regel nicht verfügbar sind. Die einzige existierende standardisierte Screening-Assays anwendbar ist die sogenannte Calgary Biofilm Gerät, aus dem der handelsüblichen Mindest Biofilm Eliminieren Konzentration (MBEC) System wurde 13-15 entwickelt. Allerdings ist die Begrenzung dieses Tests, daß die Biofilme auf Zapfen aufgewachsen sind, und nicht alle Bakterienarten oder sogar Stämmen innerhalb derselben Spezies können Biofilme auf diesem Gerät zu bilden. Darüber hinaus Methoden, die besonders auf die Erforschung von Naturstoffen angewendet werden können, sinderforderlich. Natürliche Produkte haben die Hauptquelle für Innovationen in der antimikrobiellen Wirkstoffforschung im vergangenen Jahrhundert 16 gewesen. Sie können neuartige Anti-Biofilm-Verbindungen mit einzigartigen Wirkmechanismen zur Verfügung stellen, die auch wirksam gegen persister Zellen sein kann. Somit hat die Erforschung der natürlichen und natürlich inspirierten Bibliotheken hohe Chancen zur Herstellung von vielversprechenden und einzigartige Anti-Biofilm führt.
Hier stellen wir die experimentellen Details einer Plattform von Assays , die für die chemische Screening von Anti-Biofilm – Verbindungen unter Verwendung von drei Assays Zur Messung der Wirkungen auf die Lebensfähigkeit, Gesamtbiomasse und Matrix von Staphylococcus aureus Biofilm entwickelt wurde. Der erste Test misst Biofilm Lebensfähigkeit und es wird basierend auf Resazurin-Färbung. Resazurin ist ein Redox-Farbstoff, der in seinem oxidierten Zustand blau und nicht-fluoreszierend ist und verwandelt sich in rosa, stark fluoreszierenden Resorufin, wenn sie durch die Stoffwechselaktivität der Bakterien reduziert. Es ist eine sehr einfache und schnelle methode geeignet für primäre Screenings 17-20. Der zweite Test, basierend auf Kristallviolett-Färbung misst Gesamtbiofilmmasse. Kristallviolett ist eine weit verbreitete Färbung für 19,21-23 Bakterien und Bakterien in Biofilmen zu studieren. Der Test basiert auf kostengünstigen Reagenzien und hat eine einfache Absorption Endpunkt Lesen. Schließlich zielt die dritte Assay die extrazelluläre polymere Substanz (EPS) -Matrix des Biofilms durch Weizenkeim – Agglutinin (WGA), die spezifisch N – acetyl-Glucosamin – Reste (PNAG) in der Matrix von Staphylokokken – Biofilme 24 bis Poly- bindet. Die WGA wird mit einem Fluorophor konjugiert ist , der 25 unter Verwendung von Fluoreszenzintensitäts Leser erkannt werden kann. Wir stellen Ihnen hier die Gründe und Einzelheiten der Plattform, die wir entwickelt, darunter Beispiele für Anwendungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt keine einzige Methode, die gleichzeitig die Wirkung einer Verbindung auf die Lebensfähigkeit messen kann, Biomasse und Biofilmmatrix. Daher besteht ein Bedarf an Assays, um die Kombination eine Wirkung auf die drei Endpunkte, vorzugsweise an einem primären Siebstufe zu detektieren.
Resazurin ist ein sehr einfaches Färbeprotokoll nur von der Zugabe des Redox-Sonde besteht. Jedoch mit der Resazurin die optimale Inkubationszeit der Biofilme Festlegung ist entscheidend für den Erfolg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Professor Paul Cos und LMPH, Universität Antwerpen, Belgien für seine Unterstützung während der Dreharbeiten in seinem Labor. Diese Arbeit wurde von Academy of Finland geförderten Projekte (Projekte 272.266 und 282.981) und Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finnland. Die technischen Beiträge von MSc Janni Kujala werden anerkannt.
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
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