Una piattaforma di test anti-biofilm Adatto per l'esplorazione del Biblioteche composto naturale
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
I biofilm sono considerati come uno dei temi più impegnativi della moderna biomedicina, e sono potenzialmente responsabili di oltre l'80% delle infezioni antibiotico-tolerant. I biofilm hanno mostrato un livello eccezionalmente alto di tolleranza per la chemioterapia, che è pensato per essere multifattoriale. Per esempio, la matrice fornisce una barriera fisica che diminuisce la penetrazione di antibiotici nel biofilm. Inoltre, le cellule all'interno dei biofilm sono fenotipicamente diverse. Probabilmente, biofilm resilienza deriva da una combinazione di questi e altri, ancora sconosciute, meccanismi. Tutti gli antibiotici attualmente esistenti sono stati sviluppati contro singole cellule-batteri (planctonici). Pertanto, finora, un repertorio molto limitato di molecole esiste che può selettivamente agire su biofilm maturi. Questa situazione ha portato un cambiamento di paradigma progressiva scoperta di nuovi farmaci, in cui la ricerca di anti-biofilm è stata invitata ad occupare un posto più prominente. Una sfida ulteriore è che ci sono unnumero di metodi standardizzati per la ricerca biofilm, in particolare quelli che possono essere utilizzati per lo screening su larga rendimento di librerie chimiche molto limitato. Qui, una piattaforma anti-biofilm sperimentale per lo screening chimico è presentato. Colorazione Esso utilizza tre metodi per misurare la vitalità del biofilm (con resazurina colorazione), biomassa totale (con colorazione cristallo viola), e la matrice del biofilm (utilizzando un agglutinine di germe di grano, WGA-fluorescenza a base di poli-N acetil-glucosamina, PNAG , frazione). Tutti i saggi sono stati sviluppati usando Staphylococcus aureus come i batteri modello. Esempi di come la piattaforma può essere utilizzata per lo screening primario e per la caratterizzazione funzionale identificati risultati anti-biofilm sono presentati. Questa sequenza sperimentale inoltre consentito la classificazione dei risultati basati sui punti finali misurati. Esso fornisce anche informazioni sulle loro modalità di azione, in particolare sul lungo termine rispetto agli effetti chemioterapici a breve termine. Pertanto, è molto advantageous per la rapida identificazione di composti di successo di alta qualità che possono servire come punto di partenza per varie applicazioni biomediche.
Introduction
I batteri possono passare tra due diversi stili di vita, planctonici e sessili, di cui un biofilm è l'esempio più comune. In biofilm, batteri formano comunità strutturate annegate in una matrice di auto-prodotto 1. Questa matrice autoprodotto è una barriera tra i batteri e l'ambiente esterno, e protegge le cellule microbiche, mantenendoli in prossimità. La composizione della matrice biofilm varia tra e persino all'interno delle specie, ma consiste principalmente di una fitta rete di lipopolisaccaridi, DNA extracellulare e proteine. La matrice serve come barriera fisica inibendo l'ingresso di agenti nocivi, ma protegge anche il biofilm dalla disidratazione e impedisce la fuoriuscita nutrienti cella 2.
I biofilm sono considerati come uno dei temi più impegnativi della moderna biomedicina, e sono presumibilmente responsabili di oltre l'80% delle infezioni antibiotico-tolerant 3. essi DISPgettare un intrinsecamente un'elevata tolleranza contro le minacce esterne: umidità, pressione osmotica, stress meccanico 4, calore, radiazioni UV 5, disinfettanti, agenti antimicrobici, e l'host del sistema immunitario 1. Ad esempio, la concentrazione dell'agente antimicrobico richiesto richiesto per uccidere un biofilm ha dimostrato di essere fino a 1000 volte superiore rispetto a quella richiesta per uccidere i batteri planctonici. La spiegazione di questa tolleranza superiore sembra essere multifattoriale. La matrice fornisce una barriera fisica che diminuisce la penetrazione di antibiotici nel biofilm. Inoltre, le cellule all'interno dei biofilm sono fenotipicamente diversi; la fase di transizione tra stati metabolici causa di un gradiente esistente di ossigeno, nutrienti e metaboliti tra le parti interne ed esterne del biofilm 6. Pertanto, in alcune regioni biofilm, come il nucleo, i batteri sono privati di ossigeno e nutrienti e vivono in un metabolicamente meno attivo o uno stato completamente dormiente <sup> 7. Le cellule dormienti completamente sono indicati come cellule persister, e non sono suscettibili di convenzionali trattamenti antimicrobici 8. Pertanto, è probabile che biofilm resilienza deriva da una combinazione dei meccanismi attualmente proposti e altri, ancora sconosciute. Staphylococcus spp. sono ancora tra i batteri gram-positivi più problematici, causando gravi, spesso biofilm-correlati, infezioni 4. Si suggerisce che fino al 99% di tutti i batteri sono associati all'interno di biofilm, il che rende lo stile di vita batterica predominante 3. Tuttavia, tutti gli antibiotici attualmente esistenti sono stati sviluppati contro batteri (planctonici) unicellulari. Finora, un repertorio molto limitato di molecole esiste che può selettivamente agire su biofilm maturi. Questa situazione ha portato un cambiamento di paradigma progressiva scoperta di nuovi farmaci, in cui la ricerca di anti-biofilm è stata invitata ad occupare un posto più prominente.
Da un methodologprospettiva iCal, esistono ulteriori sfide, come solo un numero limitato di metodi di biofilm sono stati sviluppati da organismi di normazione, in particolare quelle applicabili al high-throughput screening di librerie chimiche. Tutti i test standardizzati (con una sola eccezione) sono basate su reattori a biofilm, e questi metodi richiedono grandi volumi di lavoro e di grandi quantità di composti da testare, che di solito sono disponibili durante la fase iniziale di sperimentazione 9-12. Il test di screening-applicabile standardizzato solo esistente è il cosiddetto dispositivo Calgary Biofilm, da cui il sistema commercialmente disponibile minimo biofilm eliminando concentrazione (MBEC) è stato sviluppato 13-15. Tuttavia, la limitazione di questo saggio è che il biofilm sono coltivate su pioli, e non tutte le specie batteriche o anche ceppi della stessa specie sono in grado di formare biofilm su questo dispositivo. Inoltre, metodi che possono essere particolarmente applicati all'esplorazione di composti naturali sononecessario. Prodotti naturali sono stati la fonte principale per l'innovazione nella scoperta di farmaci antimicrobici nel corso dell'ultimo secolo 16. Essi possono fornire composti anti-biofilm nuovi meccanismi d'azione unici che possono anche essere efficaci contro le cellule persister. Così, l'esplorazione di librerie naturali e naturalmente ispirati ha alte probabilità di produrre cavi anti-biofilm promettenti e uniche.
Qui, presentiamo i dettagli sperimentali di una piattaforma di test che è stato sviluppato per la proiezione chimica dei composti anti-biofilm utilizzando tre metodi per misurare gli effetti sulla vitalità, biomassa totale, e la matrice di biofilm Staphylococcus aureus. Il primo test misura biofilm vitalità, e si basa su resazurina colorazione. Resazurina è una macchia redox che è blu e non fluorescente nel suo stato ossidato e si trasforma in rosa resorufina, altamente fluorescenti quando ridotto l'attività metabolica dei batteri. E 'molto semplice e veloce metodo adatto per proiezioni primari 17-20. Il secondo test, basato su cristalli colorazione violetta, misura massa totale biofilm. Cristallo viola è una macchia ampiamente utilizzato per lo studio di batteri e batteri nel biofilm 19,21-23. Il test è basato su reagenti poco costosi e ha una lettura semplice assorbanza finale. Infine, il terzo test rivolge la sostanza polimerica extracellulare (EPS) -matrix del biofilm tramite germe di grano agglutinina (WGA), che si lega specificamente alla poli- N residui acetil-glucosammina (PNAG) presenti nella matrice del biofilm stafilococciche 24. Il WGA è coniugato con un fluoroforo che può essere rilevato con i lettori intensità di fluorescenza 25. Vi presentiamo qui le motivazioni e dettagli della piattaforma abbiamo sviluppato, con esempi di applicazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Non esiste un unico metodo che può misurare simultaneamente l'effetto di un composto sulla viabilità, biomassa e matrice di biofilm. Pertanto, vi è la necessità per combinare saggi per rilevare un effetto sui tre endpoint, preferibilmente in una fase screening primario.
Resazurina è molto semplice protocollo di colorazione costituito solo l'aggiunta della sonda redox. Tuttavia, stabilire il tempo di incubazione ottimale dei biofilm con il resazurina è cruciale per il successo d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il professor Paul Cos e LMPH, Università di Anversa, in Belgio per il suo supporto durante il processo di ripresa nel suo laboratorio. Questo lavoro è stato finanziato dalla Academy of Finland progetti (progetti 272.266 e 282.981) e Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandia. I contributi tecnici del Master Janni Kujala sono riconosciuti.
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
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