天然化合物ライブラリーの探査に適した抗バイオフィルムアッセイのプラットフォーム
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
バイオフィルムは、現代の生物医学の最も困難な課題の一つと考えられている、と彼らは、潜在的に抗生物質耐性の感染症の80％を担っています。バイオフィルムは、多因子性であると考えられている化学療法に対する非常に高い耐性を示しています。例えば、マトリックスは、バイオフィルムへの抗生物質の浸透を減少させる物理的なバリアを提供します。また、バイオフィルム内の細胞は、表現型が多様です。そう、バイオフィルムの回復力は、これらおよび他の、未知の機構の組み合わせから生じます。現在、既存の抗生物質の全ては、単一細胞（浮遊性）細菌に対して開発されてきました。そのため、これまでのところ、分子の非常に限られたレパートリーは、それが選択的に成熟したバイオフィルムに作用することができる存在します。この状況は、抗バイオフィルムのための検索は、より目立つ場所を占めるように促しされた薬物の発見における漸進的パラダイムシフトを、推進してきました。追加の課題があるということですバイオフィルム研究のための標準化された方法、化学ライブラリーの大スループットスクリーニングのために使用することができる特に、非常に限られた数。ここでは、化学物質のスクリーニングのための実験的な抗バイオフィルムのプラットフォームが提供されます。それは、（レサズリン染色）バイオフィルムの生存率を測定するための3つのアッセイを使用しています（クリスタルバイオレット染色）総バイオマス、およびバイオフィルムマトリックス（ポリN –アセチルグルコサミンのコムギ胚芽凝集素を使用して、WGA-蛍光ベースの染色、PNAG 、分数）。すべてのアッセイは、モデル菌として黄色ブドウ球菌を使って開発されました。プラットフォームは、一次スクリーニングのために、ならびに同定された抗バイオフィルムヒットの機能的特徴付けのために使用することができる方法の例が示されています。この実験的なシーケンスは、さらに測定のエンドポイントに基づいて、ヒットの分類を可能にします。また、特に短期化学療法の効果に対する長期的に、それらの作用モードの情報を提供します。したがって、それは非常にアドバです様々な生物医学的応用のための出発点として機能することができ、高品質のヒット化合物の迅速な同定のためのntageous。
Introduction
細菌はバイオフィルムは、最も一般的な例となっている2つの非常に異なる生活様式、プランクトンや固着、切り替えることができます。バイオフィルムでは、細菌はセルフプロデュースマトリックス1に埋め込まれた構造化されたコミュニティを形成します。この自己生産マトリックスは、細菌とその外部環境との間の障壁であり、それは近接してそれらを維持する、微生物細胞を保護します。バイオフィルムマトリックスの組成物は、間にあっても種内で変化するが、それは主にリポ多糖、細胞外DNA、およびタンパク質の緊密なネットワークで構成されています。マトリックスは、有害物質の進入を阻害する物理的障壁として働くが、それはまた、脱水からバイオフィルムを保護し、セル2から逃げるの栄養素を防ぐことができます。
バイオフィルムは、現代の生物医学の最も困難な課題の一つとみなされ、それらは、抗生物質耐性の感染症3の80％以上のためのうわさによれば、責任があります。彼らは、DISP湿度、浸透圧、機械的ストレス4、熱、UV照射5、殺菌剤、抗菌剤、および宿主免疫系1：外部の脅威から本質的に高い耐性を築きます。例えば、バイオフィルムを殺すために必要な必要な抗菌剤の濃度は、浮遊細菌を死滅させるために必要なものと比較して最大で1000倍高いことが示されています。この高い耐性についての説明は、多因子であると思われます。マトリックスは、バイオフィルムへの抗生物質の浸透を減少させる物理的なバリアを提供します。また、バイオフィルム内の細胞は、表現型が多様です。それらが原因のバイオフィルム6の内側と外側の部分との間の酸素、栄養素、および代謝産物の既存の勾配に異なる代謝状態間の遷移します。したがって、このようなコアのようないくつかのバイオフィルム領域において、細菌は、酸素と栄養を奪われていると代謝活性の低いまたは完全に休止状態に住んでいます<suP> 7。完全に休眠細胞は存続細胞と呼ばれ、それらは、従来の抗菌治療8の影響を受けやすいものではありません。従って、バイオフィルムの回復力は、現在提案及び他の、未知の機構の組み合わせから生じる可能性があります。 ブドウ球菌属 。厳しい、多くの場合、バイオフィルム関連、感染4を引き起こし、最も問題とグラム陽性菌の中ではまだです。すべての細菌の最大99％がそれ優勢な細菌のライフスタイル3作り、バイオフィルム内に関連していることが示唆されています。しかし、現在、既存の抗生物質のすべては、単一細胞（浮遊性）細菌に対して開発されてきました。これまでのところ、分子の非常に限られたレパートリーは、それが選択的に成熟したバイオフィルムに作用することができる存在します。この状況は、抗バイオフィルムのための検索は、より目立つ場所を占めるように促しされた薬物の発見における漸進的パラダイムシフトを、推進してきました。
methodologからiCalの斜視バイオフィルム法の限られた数だけが、標準化団体、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適用特ににより開発されているように、追加の課題が存在します。 （唯一の1つの例外を除いて）すべての標準化されたアッセイは、バイオフィルムリアクターに基づいて、これらの方法は、通常、初期の治験段階9-12中は利用できません大きな作業量と試験すべき化合物を大量に必要としています。唯一の既存の標準化されたスクリーニング-適用アッセイは、市販の最小バイオフィルム排除濃度（MBEC）システムは13-15を開発された、いわゆるカルガリーバイオフィルムデバイス、です。しかし、このアッセイの制限は、バイオフィルムは、ペグ上に成長しており、すべての細菌種または同じ種内でも株はないが、この装置にバイオフィルムを形成することができるということです。また、特に、天然化合物の探索にも適用することができる方法であります必要に応じて。天然物は、前世紀16以上の抗菌薬の発見の革新のための主要な源となっています。彼らはまた、存続細胞に対して有効であることができるユニークな作用機序を有する新規抗バイオフィルム化合物を提供することができます。このように、自然と自然にインスピレーションを得たライブラリの探査は、有望な、ユニークな抗バイオフィルムリードを製造する高い可能性を持っています。
ここでは、 黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの生存率、総バイオマス、およびマトリックスに対する効果を測定するための3つのアッセイを用いて、抗バイオフィルム化合物の化学的スクリーニングのために開発されたアッセイのプラットフォームの実験の詳細を提示します。第一のアッセイは、バイオフィルムの生存率を測定し、それはレザズリン染色に基づいています。レサズリンは、その酸化状態にある青と非蛍光であり、細菌の代謝活性によって減少するとき、ピンク、蛍光性の高いレゾルフィンになるレドックス染色です。これは非常にシンプルかつ高速メートルです一次スクリーニング17-20に適しethod。クリスタルバイオレット染色に基づく第2のアッセイは、全バイオフィルムの質量を測定します。クリスタルバイオレットは、バイオフィルム19,21-23中の細菌や細菌を研究するために広く使用されている染色です。アッセイは、安価な試薬に基づいており、単純な吸光度エンドポイント測定値を有しています。最後に、第3のアッセイは、ブドウ球菌のバイオフィルム24のマトリクス中に存在するN-アセチルグルコサミン残基（PNAG）をポリ-するために特異的に結合するコムギ胚芽凝集素（WGA）を介して細胞外高分子物質（EPS）バイオフィルムの-マトリックスを対象としています。 WGAは、蛍光強度リーダ25を用いて検出することができるフルオロフォアとコンジュゲートされています。ここでは、我々はアプリケーションの例を含め、開発プラットフォームの根拠と詳細を提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
同時に生存力、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスに対する化合物の効果を測定することができる単一の方法はありません。したがって、好ましくは、一次スクリーニング段階で三のエンドポイントへの影響を検出するためのアッセイを組み合わせる必要があります。
レサズリンは、レドックスプローブの添加のみからなる非常に単純な染色プロトコルで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼の研究室での撮影プロセスの間に彼のサポートのための教授ポールコスとLMPH、アントワープ大学、ベルギーに感謝します。この作品は、フィンランドのプロジェクトアカデミー（272266と282981を投影）とスヴェンスカTekniska Vetenskapsakademien私フィンランドによって賄われていました。修士課程Janniクジャラの技術的な貢献が認められています。
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
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