Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken
Summary
Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Abstract
Biofilms worden beschouwd als een van de meest uitdagende onderwerpen moderne biogeneeskunde en het potentieel verantwoordelijk voor meer dan 80% van antibiotica-tolerante infecties. Biofilms hebben een uitzonderlijk hoge tolerantie voor chemotherapie, waarvan wordt gedacht multifactoriële te zijn weergegeven. Bijvoorbeeld, de matrix levert een fysieke barrière die het binnendringen van antibiotica vermindert in de biofilm. Ook cellen in de biofilm fenotypisch verschillend. Waarschijnlijk biofilm veerkracht ontstaat door een combinatie van deze en andere, nog onbekende mechanismen. Alle momenteel bestaande antibiotica zijn ontwikkeld tegen één-cellen (planktonische) bacteriën. Derhalve tot nu toe een zeer beperkte repertoire van moleculen bestaat die selectief werken op rijpe biofilms. Deze situatie heeft een progressieve paradigmaverschuiving in drug discovery, waarin op zoek naar anti-biofilms werd aangespoord om een meer prominente plaats innemen gereden. Een bijkomend probleem is dat er eenzeer beperkt aantal gestandaardiseerde biofilm onderzoek, met name die kan worden gebruikt voor grote verwerkingscapaciteit screenen van chemische bibliotheken. Hier wordt een experimentele anti-biofilm platform voor chemische screening gepresenteerd. Het maakt gebruik van drie bepalingen om biofilm levensvatbaarheid (met Resazurin kleuring), totale biomassa (met kristalviolet kleuring) en biofilm matrix (gemeten met behulp van een tarwekiem agglutinine, WGA-fluorescentie-gebaseerde kleuring van het poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG , fractie). Alle testen werden ontwikkeld met behulp van Staphylococcus aureus bacteriën als model. Voorbeelden van het platform kan worden gebruikt voor primaire screening en voor functionele karakterisering van geïdentificeerde anti-biofilm hits worden gepresenteerd. Deze experimentele sequentie verder zorgt voor de indeling van de treffers op basis van de gemeten eindpunten. Het biedt ook informatie over hun werkingsmechanisme, vooral op lange termijn versus korte termijn chemotherapeutische effecten. Het is dus zeer Advantageous voor de snelle identificatie van hoogwaardige hit verbindingen die als uitgangspunt kunnen dienen voor diverse biomedische toepassingen.
Introduction
Bacteriën kunnen schakelen tussen twee zeer verschillende levensstijlen, plankton en zittend, waarvan een biofilm is de meest voorkomende voorbeeld. In biofilms, bacteriën vormen gestructureerde gemeenschappen ingebed in een zelfgeproduceerde matrix 1. Dit zelf geproduceerde matrix is een barrière tussen de bacteriën en hun externe omgeving, en het beschermt de microbiële cellen, waardoor ze in de buurt. De samenstelling van de biofilm matrix varieert tussen en zelfs binnen soorten, maar bestaat voornamelijk uit een dicht netwerk van lipopolysacchariden, extracellulair DNA en eiwitten. De matrix dient als een fysieke barrière remmen van de ingang van schadelijke stoffen, maar beschermt ook de biofilm tegen uitdroging en voorkomt voedingsstoffen ontsnapt de cel 2.
Biofilms worden beschouwd als een van de meest uitdagende onderwerpen moderne biogeneeskunde en ze ogenschijnlijk verantwoordelijk voor meer dan 80% van antibiotica-tolerante infecties 3. ze displegt een inherent hoge tolerantie tegen externe bedreigingen vochtigheidsgraad, osmotische druk, mechanische belasting 4, warmte, UV straling 5, desinfecterende middelen, antimicrobiële middelen en gastheerimmuunsysteem 1. Zo heeft de vereiste antimicrobiële middel concentratie vereist om een biofilm te doden aangetoond tot 1000 maal hoger in vergelijking met die welke vereist is planktonische bacteriën te doden. De verklaring voor deze hogere tolerantie lijkt multifactorieel. De matrix bevat een fysieke barrière die het binnendringen van antibiotica vermindert in de biofilm. Ook cellen binnen de biofilms zijn fenotypisch divers; zij overgang tussen verschillende metabolische toestanden als gevolg van een bestaande gradiënt van zuurstof, voedingsstoffen en metabolieten tussen de binnenste en buitenste delen van de biofilm 6. Dus in sommige biofilm gebieden, zoals de kern, bacteriën zijn verstoken van zuurstof en voedingsstoffen en in een metabolisch minder actieve of volledig rusttoestand <sup> 7. De volledig slapende cellen worden aangeduid als persistorcellen, en ze zijn ongevoelig voor conventionele antimicrobiële behandelingen 8. Derhalve is het waarschijnlijk dat biofilm veerkracht ontstaat door een combinatie van de momenteel voorgesteld en andere, nog onbekende mechanismen. Staphylococcus spp. nog steeds tot de meest problematische gram-positieve bacteriën, waardoor ernstige, vaak biofilm-gerelateerde infecties 4. Wordt voorgesteld dat tot 99% van alle bacteriën zijn geassocieerd in biofilms, waardoor het de overheersende bacteriële levensstijl 3. Alle op de nog bestaande antibiotica zijn ontwikkeld tegen eencellige (planktonische) bacteriën. Momenteel werkt een zeer beperkte repertoire van moleculen bestaat die selectief werken op rijpe biofilms. Deze situatie heeft een progressieve paradigmaverschuiving in drug discovery, waarin op zoek naar anti-biofilms werd aangespoord om een meer prominente plaats innemen gereden.
Vanuit methodological perspectief, extra uitdagingen bestaan, aangezien slechts een beperkt aantal biofilm methoden zijn ontwikkeld door normalisatie-organisaties, met name die van toepassing zijn op de high-throughput screening van chemische bibliotheken. Alle gestandaardiseerde assays (op één uitzondering na) zijn gebaseerd op biofilmreactoren, en deze werkwijzen vereisen grote hoeveelheden werk- en grote hoeveelheden van te onderzoeken verbindingen, die gewoonlijk beschikbaar tijdens de vroege experimentele stadium 9-12. De enige bestaande gestandaardiseerde screening-toepassing test is de zogenaamde Calgary Biofilm apparaat, waaruit de handel verkrijgbare minimale biofilm elimineren concentratie (MBEC) systeem ontwikkeld 13-15. De beperking van deze test is dat de biofilms worden geteeld op pennen, en niet elke bacteriële species of stammen binnen dezelfde soort kunnen biofilms deze inrichting te vormen. Bovendien methoden die met name kunnen worden toegepast op de exploratie van natuurlijke verbindingennodig. Natuurlijke producten zijn de belangrijkste bron voor innovatie in antimicrobiële drug discovery in de afgelopen eeuw 16 geweest. Ze kunnen nieuwe anti-biofilm verbindingen te voorzien van unieke werkingsmechanismen die ook effectief tegen persistorcellen kan zijn. Zo is de exploratie van natuurlijke en natuurlijk geïnspireerd bibliotheken heeft een hoge kans op het produceren van veelbelovende en unieke anti-biofilm leads.
Hier presenteren we de experimentele gegevens van een platform van assays die is ontwikkeld voor het screenen van chemische anti-biofilm verbindingen met behulp van drie tests om de effecten op de levensvatbaarheid, totale biomassa en matrix van Staphylococcus aureus biofilms meten. De eerste assay meet biofilm levensvatbaarheid en het is gebaseerd op resazurin kleuring. Resazurin is een redox vlek die is blauw en niet-fluorescerende in zijn geoxideerde toestand en kleurt roze, sterk fluorescerende resorufine wanneer het gereduceerd door metabolische activiteit van de bacteriën. Het is een zeer eenvoudige en snelle methode geschikt voor primaire screenings 17-20. De tweede test, op basis van kristalviolet kleuring, meet totale biofilm massa. Crystal violet is een veel gebruikte vlek voor het bestuderen van bacteriën en bacteriën in biofilms 19,21-23. De test is gebaseerd op goedkope reagentia en heeft een eenvoudige absorptie eindpunt lezen. Het derde onderzoek richt de extracellulaire polymere stoffen (EPS) -matrix van de biofilm via tarwekiem agglutinine (WGA), dat specifiek bindt aan N-acetyl-glucosamine residuen (PNAG) aanwezig in de matrix op Staphylococcus biofilms 24 poly-. De WGA is geconjugeerd met een fluorofoor die kan worden gedetecteerd via fluorescentie-intensiteit lezers 25. Wij presenteren hier de reden en de details van het platform dat we ontwikkeld, met inbegrip van voorbeelden van toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er is geen enkele methode die tegelijkertijd het effect van een verbinding op de levensvatbaarheid, biomassa en biofilm matrix kan meten. Daarom is er een behoefte voor het combineren assays om een effect te detecteren op de drie eindpunten, bij voorkeur bij een primaire screening fase.
Resazurin is een zeer eenvoudige kleuringsprotocol waarop uitsluitend de toevoeging van de redox probe. De vaststelling van de optimale incubatietijd van de biofilms met Resazurin is cruciaal voor het s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken professor Paul Cos en LMPH, Universiteit Antwerpen, België voor zijn steun tijdens de opnames proces in zijn laboratorium. Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland projecten (projecten 272.266 en 282.981) en Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finland. De technische bijdrage van MSc Janni Kujala worden erkend.
Materials
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
