Engineered Nisabı giderici Lactonases kullanarak Patojen Biyofilmler Anti-öldürücü bozulması
Summary
Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.
Abstract
The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.
Introduction
Bulaşıcı hastalıklar için tedavi seçenekleri, antibiyotik ilaçlar 1 bir geniş bağışıklık çok ilaca dayanıklı bakterilerin hızlı artışın daha karmaşık bir. Dirençli bakteri kaynaklı enfeksiyonlardan yüksek morbidite ve mortalite oranları ile, ilaç geliştirme süreçlerini yükselmek ve / veya tedavi seçenekleri geliştirmek için daha iyi anti-bakteriyel alternatifleri keşfetmek için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, anti-virülans yaklaşımı dolayısıyla direnç mekanizmaları 2 risklerini azaltmaya olmayan bakteri yöntemlerle virülansını önlemede potansiyeli verilen faiz kazanıyor.
Nisabı algılamalı bakteriyel virülans ve bu sinyal olgusunun bozulması bir 'ana şalteri' patogenezinde 3 karşı vadeden bir anti-virülans yöntemdir olduğunu. Kritik bakteriyel nüfus yoğunluğu ulaşıldıktan sonra virülansına başlangıcı dışı ortamda nisabı moleküllerin birikimini gerektirir. As quoROM molekülleri, komşu reseptörlerine bağlanma hastalık oluşturma faktörlerinin aktivasyonu gibi antibiyotik direnci ve biyofilm 4 ile ilişkili genlerin yol açar, hücre içi matris geri yayılır. Genel, nisap algılama bozulması Birincil metabolik etkilemeden nisabı molekülü ve reseptör etkileşimi inhibe içerir. Bu nedenle, hücre büyümesi üzerinde doğrudan bir ima yoktur. Fitness tehlikeye olmadığından, gelişmeye ve bu tür tedaviler 5 karşı direnç kazanmak için bakteriler için en az seçim baskı var. Buna ek olarak, çekirdek-algılama bozulması, anti-bakteriyel maddeler karşı koruma sağlar ve immün yanıtları ana biyofilm, olduğu gibi, doğal bakteri koruyucu mekanizmaların engelleyebilir.
Bu Dünya'da mikropların% 99 th içinde yaşayan mikroorganizmalar için çok önemli hayatta kalma avantajı kazandıran, karmaşık biyofilm gibi matrisler var olduğu tahmin edilmektedirese yapılar 6. Daha da önemlisi, bu sesil etki oluşumu en kalıcı ve kronik hastane kökenli enfeksiyonların 7 nedenidir. Acinetobacter baumannii küresel hastane kökenli enfeksiyonlarla ilişkilidir ve virülans büyük ölçüde yeterli çoğunluk algılama atfedilir Belli başlı insan patojenleri biridir aracılı biyofilm oluşumu 8. Çekirdek giderici enzimler, Gram-negatif bakterilerin 9 tarafından üretilen N -asil homoserin laktonlar (AHL'ler) olarak bilinen bir bileşikler grubu hedef, çekirdek-kaynaklı sinyal transdüksiyonunun bozulması başarıyla kullanılmıştır. Çeşitli çalışmalar da biyofilm 10,11 virülans faktörü ekspresyonu ve hücre sayılarının azaltılması yoluyla bakteriyel hastalık oluşumunun engellemek için bu enzimlerin kullanımına bağlı genişletmiştir. Ne yazık ki, bakteriyel patojenler tarafından biyofilm oluşumuna karşı nisabı-söndürme enzimlerin etkin kullanımı palpabl gösteri eksikliği kalır.Yeniden A. bozmaya, nisap inhibitörleri (AHL analogları), yerine nisabı giderici enzimler kullanmayı girişimleri olmuştur baumannii biyofilm oluşumu 12. Küçük moleküller inhibitörleri kullanılarak bu yöntem, geçerli bir yaklaşım olsa da, translasyon kullanımlarda, bio-mevcudiyetini sürdürülmesi zor olabilir. Enzimler terapötik etkileri için biyomedikal cihazların yüzeylerine immobilizasyon doğru daha uygundurlar Aksine, katalitik çekirdek giderici enzimlerin kullanılması biyolojik sorunu aşmak olabilir.
Burada, kristal viyole boyama ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, Geobacillus kaustophilus (GKL) bakteriyel biyofilm oluşumu üzerinde 13'ten mühendislik nisap-söndürme lactonases etkilerinin bir değerlendirmesini açıklar. Bu çalışma klinik olarak anlamlı A. biyofilm bozulması ilk başarılı gösteri nisap giderici enzimler kullanılarak baumannii S1 süzün. Yöntem tarifBu çalışmada, patojenik Gram-negatif bakterilere karşı sonraki terapötik geliştirme çabaları diğer çekirdek giderici enzimlerin etkinliğini değerlendirmek için yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deney iki seti olarak, A. baumannii S1 bakteriler 15 tarafından oluşturulan biyofilm miktarını azaltabilir yüksek tuz konsantrasyonu olarak NaCl'siz LB ortamında kültive edilmiştir. Bu tür eserin varlığı oluşturduğu biyofilm miktarını, hem de farklı tedavi koşulları arasında nisabı-söndürme enzimlerin etkisini hafife olabilir. Katalitik inaktif enzim kullanımı enzim sekestrasyonun olası etkilerini ortadan kaldırmak için bir negatif kontrol olarak önemlidir. I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.
Materials
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?. Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms–how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?. Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H., Rumbaugh, K. P. Ch. 19. Quorum Sensing. 692, 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
