שיבוש אנטי-ארסי של Biofilms פתוגניים באמצעות Lactonases תכנון הנדסי Quorum-מרווה
Summary
Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.
Abstract
The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.
Introduction
אפשרויות טיפול במחלות זיהומיות כבר מסובכות על ידי הגידול המהיר בחיידקים עמיד multidrug כי הם חסינים מפני מגוון רחב של תרופות אנטיביוטיות 1. עם תחלואה גבוהה ושיעורי תמותה מזיהומים בתיווך חיידקים עמידים, יש צורך להסלים תהליכי פיתוח תרופות ו / או לחקור חלופות אנטי בקטריאלי טובים יותר כדי לשפר את האפשרויות טיפוליות. בזמן האחרון, הגישה האנטי-האלימות היא צוברת ריבית נתון את הפוטנציאל שלה במניעת אלימות באמצעות שיטות לא-bactericidal, ומכאן מקלים הסיכונים של מנגנוני התנגדות 2.
מניין החישה היא "מתג ראשי" בארסיות ושיבוש תופעת איתות זה חיידקים הוא שיטה אנטי-אלימות נגד מבטיחה פתוגנזה 3. תחילתה של אלימות דורשת ההצטברות של מולקולות מניין בסביבה תאית לאחר שהגיעה לצפיפות אוכלוסיית חיידקים קריטית. כקווהמולקולות רום מפוזרות בחזרה לתוך המטריצה תאית, מחייב עם קולטנים המקור שלהם מובילה להפעלה של גורמים ארסי כמו גם גנים הקשורים לעמידות לאנטיביוטיקה והיווצרות biofilm 4. בשיבוש כללי, מניין חישה כרוך עיכוב מולקולת מניין ואינטראקציה קולט מבלי להשפיע על מסלולי מטבוליים עיקריים. מכאן, שאין לה שום השלכה ישירה על צמיחה סלולרית. מאז כושר לא נפגעים, יש לחץ בחירה מינימאלי לחיידקים להתפתח ולהשיג התנגדות נגד טיפולים כגון 5. בנוסף, הפרעה מניין חישה יכולה להפריע למנגנוני הגנת חיידקים טבועים, כמו במקרה של היווצרות biofilm, המספקת הגנה מפני חומרים אנטי-בקטריאלי ויארח את תגובה חיסונית.
הערכה היא כי 99% מחיידקים על פני כדור הארץ קיימים במטריצות כמו biofilm-מורכבות, המקנות יתרונות הישרדות חיוניות למיקרואורגניזמים שחיים בתוך המבני ESE 6. יותר מכך, היווצרות של תחומים נייחים אלה היא הסיבה לזיהומים נרכשים בבית חולים מתמשכים והכרוניים ביותר 7. Acinetobacter baumannii היא אחד מגורמי המחלה האנושיים הגדולים שמזוהה עם זיהומים נרכשים בבית חולים העולמיים והארסיות שלה מיוחסת במידה רבה למניין חישה היווצרות biofilm תיווך 8. אנזימים-מרווה מניין שימשו בהצלחה בשיבוש העברת אותות בתיווך מניין על ידי מיקוד קבוצה של תרכובות המכונית lactones -acyl N homoserine (AHLs) המיוצרים על ידי חיידקים גראם-שלילי 9. גם מספר מחקרים הרחיבו את השימוש באנזימים אלה כדי לחסום פתוגנזה של חיידקים באמצעות הפחתת מספרי ביטוי גורם ארסיות ותא בbiofilms 10,11. למרבה הצער, יש עדיין חוסר ההפגנה מוחשית של השימוש היעיל של אנזימי מרווה-מניין נגד היווצרות biofilm ידי חיידקים פתוגנים.מחדש נעשו ניסיונות להשתמש מעכבי מניין (אנלוגים AHL), במקום אנזימי מרווה-מניין, לשבש א היווצרות biofilm baumannii 12. למרות ששיטה זו של שימוש במעכבי מולקולות קטנות היא גישה חוקית, שמירה על הזמינות הביולוגית שלה בשימושים translational יכולה להיות אתגר. להיפך, השימוש באנזימי מרווה-מניין קטליטי יכול לעקוף את הבעיה הזמינות הביולוגית כאנזימים הם נוחים יותר לחוסר תנועה על משטחים של מכשירים ביו-רפואיים להשפעות טיפוליות.
כאן אנו מתארים הערכה של ההשפעות של lactonases מרווה-מניין מהונדס מkaustophilus Geobacillus (GKL) 13 על היווצרות biofilm חיידקים, באמצעות מכתים סגול גביש ומיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (CLSM). מחקר זה הוא ההפגנה המוצלחת הראשונה של שיבוש biofilm בא רלוונטי קליני זן baumannii S1 באמצעות אנזימי מרווה-מניין. השיטות שתוארובמחקר זה הם שימושיים להערכת יעילותם של אנזימי מרווה-מניין אחרים במאמצי פיתוח טיפוליים שלאחר מכן נגד חיידקים גראם שלילית פתוגניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשני הסטים של ניסוי, א baumannii S1 היה בתרבית בתקשורת LB ללא NaCl כריכוז מלח גבוה יכול להפחית את כמות biofilm נוצרה על ידי החיידקים 15. נוכחותו של חפץ כזה יכול לזלזל בסכום של biofilm נוצר, כמו גם את ההשפעות של אנזימי מרווה-מניין פני תנאי טיפול שונים. השימוש באנזים catalytically פעי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.
Materials
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?. Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms–how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?. Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H., Rumbaugh, K. P. Ch. 19. Quorum Sensing. 692, 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
