Perturbação Anti-virulenta de patogênicos biofilmes usando Engineered Quorum para saciar a Lactonases
Summary
Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.
Abstract
The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.
Introduction
As opções de tratamento para doenças infecciosas tem sido complicada pelo aumento rápido em bactérias resistentes a múltiplas drogas que são imunes a uma vasta gama de medicamentos antibióticos 1. Com alta morbidade e mortalidade por infecções de bactérias resistentes mediadas, há uma necessidade de aumentar os processos de desenvolvimento de medicamentos e / ou explorar alternativas melhores anti-bacterianos para melhorar as opções terapêuticas. Ultimamente, a abordagem anti-virulência está ganhando o interesse dado o seu potencial na prevenção de virulência por métodos de não bactericidas, portanto, reduzir os riscos de mecanismos de resistência 2.
Quorum-sensing é um "interruptor mestre" na virulência bacteriana e interrupção desse fenômeno sinalização é um método anti-virulência promissora contra patogênese 3. O aparecimento de virulência exige a acumulação de moléculas de quorum no meio extracelular após uma densidade de população bacteriana crítico é atingido. Como quomoléculas rum difundir de volta para a matriz intracelular, a ligação com os seus receptores cognatos conduz à activação de factores de virulência, bem como os genes de resistência a antibióticos associados com a formação de biofilme e 4. Em geral, a interrupção quorum-sensing envolve inibir a molécula de quorum e interação receptor sem afetar as vias metabólicas primárias. Assim, ele não tem qualquer implicação direta no crescimento celular. Desde aptidão não seja comprometida, não há pressão de seleção mínima para as bactérias a evoluir e ganhar resistência contra tais tratamentos 5. Além disso, o sensor de quorum-perturbação pode interferir com os mecanismos de protecção bacterianas inerentes, como no caso da formação de biofilme, que fornece protecção de agentes anti-bacterianos e resposta imune do hospedeiro.
Estima-se que 99% dos micróbios da Terra existir em matrizes de biofilme complexo semelhante, conferindo sobrevivência vantagens cruciais para os microrganismos que vivem dentro thestruturas ese 6. Mais importante, a formação destes domínios sésseis é a causa de infecções hospitalares mais persistentes e crônicas 7. Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos humanos que está associado a infecções hospitalares globais e sua virulência é largamente atribuído à quorum-sensing a formação de biofilme mediada 8. Enzimas de têmpera de quorum foram usados com sucesso na interrupção de transdução de sinal mediada por quorum destinada a um grupo de compostos conhecidos como N-acil homoserina lactonas (AHLs) que são produzidos por bactérias gram-negativas 9. Vários estudos também expandiu o uso destas enzimas para bloquear patogênese bacteriana através da redução dos números de expressão fator de virulência e de células em biofilmes 10,11. Infelizmente, ainda há uma falta de demonstração palpável da utilização eficaz de enzimas para saciar quórum contra a formação de biofilme por patógenos bacterianos. ore têm sido as tentativas de usar inibidores de quórum (análogos de AHL), em vez de enzimas quórum para saciar, para perturbar A. baumannii formação de biofilme 12. Embora este método de utilização de inibidores de moléculas pequenas é uma aproximação válida, mantendo a sua biodisponibilidade em utilizações de translação pode ser um desafio. Pelo contrário, a utilização de enzimas de têmpera de quorum catalíticos pode contornar o problema de biodisponibilidade como enzimas são mais favorável no sentido de imobilização em superfícies de dispositivos biomédicos para efeitos terapêuticos.
Aqui, descrevemos uma avaliação dos efeitos da lactonases para saciar quórum engenharia de Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 sobre a formação de biofilme bacteriano, utilizando a coloração violeta cristal e microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). Este estudo é a primeira demonstração bem sucedida de biofilme interrupção em um A. clinicamente relevante estirpe baumannii S1 usando enzimas de quórum para saciar. Os métodos descritosneste estudo são úteis para avaliar a eficácia de outras enzimas para saciar quórum nos esforços de desenvolvimento terapêuticas posteriores contra bactérias Gram-negativas patogénicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em ambos os conjuntos de experiência, A. baumannii S1 foi cultivada em meio LB sem NaCl como uma concentração elevada de sal pode reduzir a quantidade de biofilme formado pelas bactérias 15. A presença de tal artefacto pode subestimar a quantidade de biofilme formado, bem como os efeitos de enzimas de têmpera de quorum em diferentes condições de tratamento. O uso de uma enzima cataliticamente inactivo é importante como um controlo negativo para eliminar os possíveis efeitos de sequestro de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.
Materials
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
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