엔지니어링 정원 담금질 Lactonases를 사용하여 병원성 바이오 필름의 안티 악성 중단
Summary
Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.
Abstract
The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.
Introduction
감염성 질환에 대한 치료 옵션은 항생제 1 광범위한 면역 다제 내성 박테리아에 급격한 증가에 의해 복잡 하였다. 내성 세균 – 매개 감염에서 높은 이환율 및 사망률, 신약 개발 과정을 확대 및 / 또는 치료 옵션을 향상시키기 위해 더 항균 대안을 모색 할 필요가있다. 최근에, 항 병원성 접근법 따라서 저항 메커니즘 (2)의 위험을 완화, 비 살균 방법을 통해 독성을 예방 가능성 주어진 관심을 얻고있다.
쿼럼 센싱 박테리아 독성이 신호 현상의 중단에 '마스터 스위치'는 발병 3에 대한 유망한 항 독성 방법이다. 세균 집단 임계 밀도에 도달 한 후 독성의 발현은 세포 외 환경에서 정수 분자의 축적을 필요로한다. 로 현럼 분자는 자신의 동족 수용체와 결합하면 독성 인자의 활성화뿐만 아니라 항생제 내성 및 biofilm 형성 (4)과 관련된 유전자지도, 세포 내 매트릭스로 다시 확산. 일반적으로, 정족수 감지 중단에 차 대사 경로에 영향을주지 않고 쿼럼 분자와 수용체의 상호 작용을 억제하는 것을 포함한다. 따라서,이 세포 성장에 직접적인 의미가 없습니다. 체력이 저하되지 않기 때문에, 발전 및 치료에 대해 5 저항을 얻기위한 최소한의 박테리아 선택 압력이 존재한다. 또한, 정수 감지 중단은 항균제으로부터 보호를 제공하고, 면역 반응을 호스팅 생물막 형성의 경우와 같이, 고유 세균성 보호 메커니즘을 방해 할 수있다.
그것은 지구에 미생물의 99 %가 일 이내 거주 미생물에 중요한 생존의 장점을 부여, 복잡한 바이오 필름 같은 행렬에 존재하는 것으로 추정된다ESE 구조 6. 더욱 중요한 것은,이 고착 영역의 형성은 가장 지속적인 만성 병원 내 감염 (7)의 원인이다. Acinetobacter baumannii의 글로벌 병원 내 감염과 연관되어 있고 그 독성이 크게 정수 감지에 기인 주요 인간 병원체 중 하나 인 – 매개 biofilm 형성 8. 정원 담금질 효소는 그람 음성균 (9)에 의해 생성되는 N 아실 호모 세린 락톤 (AHLs)로 공지 된 화합물의 그룹을 대상으로하여 정수 – 매개 신호 전달을 방해에서 성공적으로 사용되어왔다. 여러 연구는 또한 생물막 10,11 독성 인자의 발현 및 세포 수의 감소를 통해 박테리아 발병을 차단하는이 효소의 용도에 확대. 불행하게도, 세균성 병원체에 의한 바이오 필름 형성에 대한 쿼럼 담금질 효소의 효과적인 사용의 만져서 알 수있는 데모의 부족이 남아있다. 그만큼다시 A를 방해, 쿼럼 억제제 (AHL 유사체), 대신 쿼럼 담금질 효소를 사용하려고왔다 baumannii의 생물막 형성 (12). 작은 분자 억제제를 사용하는이 방법은 유효한 방법이지만, 병진 용도에서의 생체 이용률을 유지하는 것은 도전이 될 수 있습니다. 효소는 치료 효과에 대한 생의학 장치의 표면에 고정화 향해 더 의무만큼 반대로, 촉매 정수 담금질 효소의 사용은 생체 이용률 문제를 회피 할 수있다.
여기, 우리는 크리스탈 바이올렛 염색 및 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)를 사용하여, Geobacillus의 kaustophilus (GKL) 세균 바이오 필름 형성에 13에서 설계 쿼럼 담금질 lactonases의 효과에 대한 평가에 대해 설명합니다. 이 연구는 임상 적으로 A의 생물막 중단되는 최초의 성공적인 데모입니다 쿼럼 담금질 효소를 사용하여 baumannii의 S1 변형. 방법 설명본 연구에서 병원성 그람 음성 세균에 대한 후속 치료 개발 노력에 다른 쿼럼 담금질 효소의 효능을 평가하는 데 유용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
실험의 두 세트에서, A. baumannii의 S1은 박테리아 (15)에 의해 형성된 바이오 필름의 양을 줄일 수있다 높은 염 농도의 NaCl없이 LB 배지에서 배양 하였다. 이러한 인공물의 존재는 생물막의 형성 량뿐만 아니라 다른 처리 조건에 걸쳐 정수 담금질 효소의 영향을 과소 있었다. 촉매 비활성 효소의 사용은 효소 격리의 가능한 효과를 제거하기 위해 음성 대조군 중요하다. 비활성 효소 쿼럼…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.
Materials
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
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