エンジニアクォーラム焼入れラクトナーゼを使用して、病原性バイオフィルムの抗病原性破壊
Summary
Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.
Abstract
The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.
Introduction
感染症の治療の選択肢は、抗生物質1の広い範囲に影響されない多剤耐性菌の急速な増加によって複雑にされています。耐性細菌媒介性感染症からの高い罹患率および死亡率と、薬物開発プロセスをエスカレートおよび/または治療選択肢を改善するための優れた抗菌選択肢を探索する必要があります。最近では、抗病原性のアプローチは、したがって耐性機構2のリスクを軽減する、非殺菌方法を介して病原性を防止する上で、その潜在的な特定の関心を集めています。
クオラムセンシングは、このシグナリング現象の細菌の病原性と混乱の「マスタースイッチが「病因3に対する有望な抗病原性の方法です。重要な細菌の人口密度に達した後毒性の発症は細胞外環境における定足数の分子の蓄積が必要です。現状として、ラム酒の分子は、その同族受容体との結合は病原性因子だけでなく、抗生物質耐性およびバイオフィルム形成を4に関連する遺伝子の活性化につながる、細胞内マトリックスに戻って拡散します。一般的には、クオラムセンシング破壊が主要代謝経路に影響を与えることなく、定足数分子と受容体の相互作用を阻害することを含みます。したがって、細胞の成長に直接的な意味合いを持っていません。適応度が損なわれないので、進化し、そのような治療5に対する耐性を得るために、細菌のための最小限の選択圧があります。また、クオラムセンシングの破壊は、抗細菌剤からの保護を提供し、免疫応答をホストしてバイオフィルム形成の場合のように、固有の細菌の防御機構を妨害することができます。
それは、地球上の微生物の99％は目の中に生きた微生物に重要な生存の利点を付与する、複雑なバイオフィルムのようなマトリックス中に存在することが推定されていますESEの構造6。さらに重要なことは、これらの固着ドメインの形成は、最も永続的なおよび慢性院内感染7の原因である。 アシネトバクターバウマニは、グローバルな院内感染に関連付けられており、その毒性が大きくクオラムセンシングに起因する主要なヒト病原体の一つであります媒介バイオフィルム形成8。クォーラム消光酵素は、グラム陰性菌9によって生成されたN -アシルホモセリンラクトン（AHLs）として知られている化合物群をターゲットにして、クォーラムが介在するシグナル伝達を妨害するで正常に使用されています。いくつかの研究はまた、バイオフィルム10,11における毒性因子の発現および細胞数の削減による細菌の病原性を遮断するために、これらの酵素の使用に拡大しています。残念ながら、細菌性病原体によるバイオフィルム形成に対する定足数消光酵素の有効利用の触知可能なデモの欠如が残っています。ザ・再A.を破壊し 、定足数阻害剤（AHL類似体）、代わりの定足数消光酵素を使用する試みてきましたバウマニバイオフィルム形成12。小分子阻害剤を使用して、この方法が有効なアプローチであるが、翻訳の用途におけるその生物学的利用能を維持することが課題であることができます。酵素は治療効果のための生物医学装置の表面上に固定化に対してより敏感に反応するように逆に、触媒定足数消光酵素の使用は、生物学的利用能の問題を回避することができます。
ここでは、クリスタルバイオレット染色および共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いて、細菌のバイオフィルム形成に13（GKL） ゲオバチルスのkaustophilusから操作さクオラムクエンチングラクトナーゼの効果の評価を説明します。この研究は、臨床的に関連するAのバイオフィルム破壊の最初に成功した実証であります定足数消光酵素を用いバウマニ S1株。方法が記載さこの研究において、病原性グラム陰性菌に対する後続の治療の開発努力の他のクオラムクエンチング酵素の有効性を評価するために有用です。
Protocol
Representative Results
Discussion
実験の両方のセットは、A.バウマンニ S1は、高い塩濃度とのNaClなしLB培地で培養したバクテリア15によって形成されたバイオフィルムの量を減少させることができます。このようなアーティファクトの存在は、バイオフィルム形成量、ならびに異なる処理条件全体の定足数消光酵素の影響を過小評価する可能性があります。触媒的に不活性な酵素の使用は、酵素隔離の影響の可?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.
Materials
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?. Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms–how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?. Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H., Rumbaugh, K. P. Ch. 19. Quorum Sensing. 692, 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
