تعطيل المضادة للضراوة من الممرضة الأغشية الحيوية باستخدام المهندسة النصاب القانوني-التبريد Lactonases
Summary
Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.
Abstract
The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.
Introduction
خيارات العلاج للأمراض المعدية قد تعقدت بسبب الزيادة السريعة في البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة التي هي في مأمن من مجموعة واسعة من المضادات الحيوية 1. مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات من مقاومة العدوى البكتيريا بوساطة، هناك حاجة لتصعيد عمليات التنمية المخدرات و / أو البحث عن بدائل مضادة للبكتيريا أفضل لتحسين الخيارات العلاجية. في الآونة الأخيرة، ونهج معاداة الفوعة تكتسب الفائدة نظرا إمكاناتها في منع الفوعة عبر وسائل غير جراثيم، وبالتالي التخفيف من مخاطر آليات المقاومة 2.
النصاب الاستشعار هو "المفتاح الرئيسي في الفوعة البكتيرية وتعطل هذه الظاهرة يشير هو وسيلة لمكافحة الفوعة واعد ضد المرضية 3. بداية الفوعة يتطلب تراكم الجزيئات النصاب في البيئة خارج الخلية بعد الوصول إلى الكثافة السكانية البكتيرية حرجة. كما الراهنجزيئات الروم منتشر مرة أخرى إلى مصفوفة الخلايا، ملزم مع مستقبلاتها وما شابه ذلك يؤدي إلى تفعيل عوامل الفوعة وكذلك الجينات المرتبطة بمقاومة المضادات الحيوية وتشكيل بيوفيلم 4. في العام، واختلال نصاب الاستشعار ينطوي على تثبيط جزيء النصاب والتفاعل مستقبلات دون التأثير على المسارات الأيضية الأساسية. وبالتالي، فإنه ليس لديها أي تأثير مباشر على نمو الخلايا. لأنه لا شبهة اللياقة البدنية، وهناك الحد الأدنى من ضغط اختيار البكتيريا في التطور واكتساب مقاومة ضد مثل هذه العلاجات 5. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعطيل النصاب الاستشعار تتداخل مع آليات الحماية البكتيرية الكامنة، كما في حالة تشكيل بيوفيلم، الذي يوفر حماية من العوامل المضادة للبكتيريا واستضافة الاستجابات المناعية.
وتشير التقديرات إلى أن 99٪ من الميكروبات على الأرض موجودة في المصفوفات مثل بيوفيلم معقدة، منح مزايا البقاء على قيد الحياة حاسمة في الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش داخل الهياكل جنوب شرقي 6. الأهم من ذلك، تشكيل هذه المجالات اطئة هو سبب العدوى المكتسبة من المستشفيات الأكثر المستمرة والمزمنة 7. راكدة بومانية هي واحدة من مسببات الأمراض البشرية الكبرى مقترن العدوى المكتسبة من المستشفيات العالمية ويعزى الفوعة إلى حد كبير إلى النصاب الاستشعار تشكيل بيوفيلم بوساطة 8. وقد استخدمت إنزيمات التبريد النصاب القانوني بنجاح في تعطيل النصاب بوساطة نقل الإشارة من خلال استهداف مجموعة من المركبات المعروفة باسم N -acyl اكتونات homoserine (AHLs) التي تنتجها البكتيريا سالبة الجرام 9. وقد وسعت العديد من الدراسات أيضا على استخدام هذه الانزيمات لمنع المرضية البكتيرية من خلال الحد من أعداد عامل الفوعة التعبير وخلية في الأغشية الحيوية 10،11. للأسف، لا يزال هناك نقص في مظاهرة اضح من الاستخدام الفعال للإنزيمات التبريد النصاب القانوني ضد تشكيل بيوفيلم عن طريق الجراثيم البكتيرية. الوقد تم إعادة محاولات لاستخدام مثبطات النصاب (نظائرها AHL)، بدلا من الانزيمات التبريد النصاب، لتعطيل A. تشكيل بيوفيلم baumannii 12. على الرغم من أن هذه الطريقة من استخدام الجزيئات الصغيرة مثبطات هو نهج صحيح، واستدامة التوافر البيولوجي في استخدامات متعدية يمكن أن يشكل تحديا. على العكس من ذلك، يمكن استخدام إنزيمات التبريد النصاب الحفازة تحايل على قضية التوافر البيولوجي كإنزيمات اكثر سهولة نحو تجميد على أسطح الطبية الأجهزة الآثار العلاجية.
هنا، نحن تصف تقييم آثار المهندسة lactonases-التبريد النصاب القانوني من Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 على تشكيل بيوفيلم البكتيرية، وذلك باستخدام تلطيخ البنفسجي الكريستال ومتحد البؤر المجهر الليزر (CLSM). هذه الدراسة هي أول مظاهرة ناجحة تعطل بيوفيلم في A. ذات الصلة سريريا سلالة baumannii S1 باستخدام أنزيمات التبريد النصاب. الطرق وصفتفي هذه الدراسة هي مفيدة لتقييم فعالية أخرى إنزيمات التبريد النصاب القانوني في جهود التنمية العلاجية اللاحقة ضد الجراثيم سلبية الغرام المسببة للأمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
في كلتا المجموعتين من التجربة، A. تم مثقف baumannii S1 في LB سائل الإعلام دون كلوريد الصوديوم حيث تركيز الملح العالية قد يقلل من كمية بيوفيلم التي شكلتها البكتيريا 15. وجود مثل هذه الأداة يمكن أن نقلل من كمية بيوفيلم تشكيلها، وكذلك آثار إنزيمات التبريد النصاب …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.
Materials
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?. Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms–how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?. Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H., Rumbaugh, K. P. Ch. 19. Quorum Sensing. 692, 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
