Turbativa Anti-virulento di patogeni biofilm utilizzando Engineered Quorum-tempra Lactonases
Summary
Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.
Abstract
The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.
Introduction
Le opzioni di trattamento per le malattie infettive sono state complicate dal rapido aumento di batteri multiresistenti che sono immuni a una vasta gamma di farmaci antibiotici 1. Con l'alta morbilità e mortalità da infezioni batteri mediata resistenti, vi è la necessità di intensificare i processi di sviluppo di droga e / o esplorare alternative migliori antibatterici per migliorare le opzioni terapeutiche. Ultimamente, l'approccio anti-virulenza sta guadagnando interesse dato il suo potenziale nella prevenzione virulenza attraverso media non battericida, quindi mitigare i rischi del meccanismi di resistenza 2.
Quorum-sensing è un 'interruttore generale' nella virulenza batterica e la rottura di questo fenomeno di segnalazione è un metodo anti-virulenza promettente contro patogenesi 3. L'insorgenza della virulenza richiede l'accumulo di molecole quorum nell'ambiente extracellulare dopo aver raggiunto una densità di popolazione batterica critica. Come quomolecole rum diffondono nella matrice intracellulare, legandosi con i loro recettori cognate porta all'attivazione di fattori di virulenza e geni associati con resistenza agli antibiotici e formazione di biofilm 4. In generale, l'interruzione del quorum sensing comporta inibendo molecola quorum e recettore senza influenzare le principali vie metaboliche. Quindi, non ha alcuna implicazione diretta sulla crescita cellulare. Dal momento che il fitness non è compromessa, c'è minima pressione selettiva per i batteri ad evolversi e acquisire resistenza contro tali trattamenti 5. Inoltre, l'interruzione quorum-sensing può interferire con i meccanismi di protezione batterici intrinseci, come nel caso della formazione del biofilm, che fornisce protezione dagli agenti antibatterici e risposta immunitaria.
Si stima che il 99% dei microbi sulla Terra esiste in matrici complesse come biofilm, le conferisce dei vantaggi di sopravvivenza fondamentali per i microrganismi che vivono all'interno thstrutture ESE 6. Ancora più importante, la formazione di questi domini sessili è la causa della maggior parte delle infezioni persistenti e croniche nosocomiali 7. Acinetobacter baumannii è uno dei principali agenti patogeni umani che è associato a infezioni contratte in ospedale globali e la sua virulenza è in gran parte attribuito al quorum sensing formazione di biofilm mediata 8. Enzimi tempra quorum sono stati utilizzati con successo in interrompere quorum mediata trasduzione del segnale di mira un gruppo di composti noti come N -acyl lattoni Homoserine (AHLs) che sono prodotte da batteri Gram-negativi 9. Diversi studi hanno inoltre ampliato sull'uso di questi enzimi per bloccare patogenesi batterica attraverso la riduzione dei numeri di espressione fattore di virulenza e di cella in biofilm 10,11. Purtroppo, permane una mancanza di manifestazione palpabile di un uso efficace di enzimi-quorum tempra contro la formazione di biofilm da batteri patogeni. Ilre sono stati tentativi di utilizzare gli inibitori del quorum (analoghi AHL), invece di enzimi quorum-tempra, di interrompere A. baumannii biofilm formazione 12. Anche se questo metodo di utilizzo di piccole molecole inibitori è un valido approccio, sostenendo la sua biodisponibilità negli usi traslazionali può essere una sfida. Al contrario, l'utilizzo di enzimi quorum tempra catalitici potrebbe aggirare il problema biodisponibilità come enzimi sono più suscettibili verso l'immobilizzazione su superfici di dispositivi biomedicali per effetti terapeutici.
Qui, descriviamo una valutazione degli effetti della ingegnerizzati-quorum tempra lactonases da Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 sulla formazione di biofilm batterico, utilizzando colorazione cristallo viola e microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Questo studio è il primo dimostrazione riuscita di interruzione biofilm in una clinicamente rilevante A. ceppo baumannii S1 utilizzando enzimi quorum-tempra. I metodi descrittiin questo studio sono utili per valutare l'efficacia di altri enzimi quorum tempra nei successivi sforzi di sviluppo terapeutici contro i batteri Gram-negativi patogeni.
Protocol
Representative Results
Discussion
In entrambe le serie di esperimenti, A. baumannii S1 è stato coltivato in LB media senza NaCl come concentrazione di sali può ridurre la quantità di biofilm formato dai batteri 15. La presenza di tale manufatto potrebbe sottovalutare la quantità di biofilm formato, nonché gli effetti degli enzimi-quorum tempra attraverso diverse condizioni di trattamento. L'uso di un enzima cataliticamente inattiva è importante come controllo negativo per eliminare i possibili effetti di enzima sequestro. <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.
Materials
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
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