Selección de alto rendimiento de las Variaciones obstinación en lignocelulósica Biomasa: Total lignina, lignina Monómeros y enzimática Azúcar de lanzamiento

Summary

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Abstract

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Introduction

A medida que la oferta mundial de combustibles no renovables y sus productos disminuciones asociadas, los científicos se han cuestionado para crear combustibles y productos químicos similares a partir de fuentes de origen vegetal ^1. Un aspecto clave de este trabajo es determinar qué especies de plantas pueden ser adecuados para la producción de biocombustibles y biomateriales ^2,3. Típicamente, estas materias primas se evalúan para la lignina, celulosa, hemicelulosa y el contenido; así como su susceptibilidad a la deconstrucción (recalcitrancia) a través de pretratamiento térmico, mecánico y / o químico con o sin posterior enzima de sacarificación. Análisis más detallados se usan para determinar la composición específica de las fracciones de lignina y hemicelulosa, así como actividades óptimas enzima necesaria. Modificaciones transgénicas de plantas que no poseen intrínsecamente características ideales para la conversión bioquímica o termoquímica a los productos básicos deseados han proporcionado a los investigadores con una fuente de gran expansión de la ollamaterias primas ciales ^4. Los métodos analíticos estándar para la cuantificación de los rasgos químicos de una planta, mientras que muy útil para pequeños conjuntos de muestras, no son adecuadas para la detección rápida de cientos o miles de muestras ^5-7. Los métodos descritos en este documento HTP se han desarrollado para evaluar rápida y eficazmente un gran número de variantes de biomasa para los cambios en la pared celular recalcitrante a la degradación termoquímica y / o enzimática.

Es fundamental entender que los ensayos de selección HTP descritos en este documento no han sido diseñados para maximizar la conversión o rendimiento. El objetivo es determinar las diferencias relativas en el recalcitrante intrínseca de muestras de biomasa relacionados. Como resultado, muchos de los pasos de análisis difieren de los ensayos de conversión de biomasa "típicos", donde el objetivo es obtener la máxima tasa de conversión o extensión. Por ejemplo, severidades de pretratamiento más bajas y tiempos más cortos de la enzima de hidrólisis se utilizan para maximizar diferircias entre las muestras. En la mayoría de los casos, las cargas relativamente altas de enzimas se utilizan para reducir las diferencias debidas a la variación experimental en la actividad enzimática, lo que podría alterar los resultados de manera significativa.

Técnicas rápidas para determinar la composición de la planta paredes celulares y los azúcares monoméricos liberados tras la sacarificación enzimática incluyen robótica,, placas de 96 pocillos termoquímicamente compatibles personalizados, y modificaciones de los métodos de laboratorio estándar ^8-11 y protocolos instrumentales, como la espectroscopia vibracional (infrarrojos (IR), de infrarrojo cercano (NIR), o Raman) y resonancia magnética nuclear (RMN) ^12-17. Estas metodologías son la clave para el aislamiento de las materias primas con alto contenido de celulosa o bajos de lignina, o los previstos para obtener el más alto de glucosa, xilosa, etanol, etc. Estos métodos han permitido a los análisis a escala reducida que emplean pequeñas cantidades de biomasa y consumibles, lo que lleva a la reducción de experimental costa ¹⁸ </sarriba>. Otra característica de este enfoque metodológico es que diversas condiciones experimentales pueden ser rápidamente, y en algunos casos de forma simultánea, evaluado. Por ejemplo, una variedad de diferentes estrategias de tratamiento previo o cócteles de enzimas puede ser probado, permitiendo que los parámetros experimentales más óptimas para identificar y emplear rápidamente. Materias primas populares, como el rastrojo de maíz ^9, álamo ^8,10, bagazo de caña ^8, y el pasto varilla ⁸ se han evaluado con éxito el uso de estos métodos HTP.

Lignina total y la composición monomérica lignina también son comúnmente cuantificados rasgos de biomasa. Las reducciones en el contenido de lignina se ha demostrado que aumentar la digestibilidad enzimática de polisacáridos ^19,20. El papel que la relación lignina monomérica (a menudo reportado como siringil / guayacil (S / G) contenido) juega en la deconstrucción de la pared celular vegetal es todavía bajo investigación. Algunos informes han indicado que las reducciones en la S / Grelación condujo a un aumento de los rendimientos de glucosa después de la hidrólisis ^{de 21 años,} mientras que otros estudios revelan la tendencia opuesta ^19,22. Métodos de alto rendimiento para la evaluación de la lignina y sus monómeros incluyen espectroscopia vibracional (IR, NIR y Raman ^23-26), junto con el análisis multivariado, y pirólisis espectrometría de masas de haz molecular (pyMBMS) ^27,28.

En el desarrollo de métodos HTP para el cribado de la biomasa, varias consideraciones integrales deben mantenerse en mente. Un aspecto clave es la complejidad del método. ¿Cuál es el nivel de habilidad requerida para la técnica? Análisis quimiométricos, por ejemplo, requieren habilidades específicas para construir, evaluar y mantener modelos predictivos. Los métodos estándar exhiben pasos de análisis preparatorio o de datos indeseables o emplean reactivos tóxicos. Desarrollo de los modelos es un proceso continuo, donde los nuevos datos se incorpora en el modelo a través del tiempo para aumentar la robustez del modelo. Otra considración es el ahorro de costes y la disminución de los tiempos de análisis experimentales de los métodos de alto rendimiento propuestos. Si el método es bastante rápida, pero muy costoso, puede que no sea una técnica viable para muchos laboratorios a adoptar. Los métodos ilustrados en este manuscrito son variantes de técnicas estandarizadas, modificados para amplificar las capacidades de rendimiento. Estos protocolos miden cuantitativamente los rasgos de biomasa de interés sin necesidad de la elaboración de modelos predictivos. Este es un atributo clave de estas técnicas, ya que los métodos de predicción, mientras que exhiben fuertes correlaciones con el estándar de análisis utilizados para desarrollar los modelos, no son tan precisos como medir realmente la cantidad de interés para las muestras. Considerando que los métodos utilizados son esencialmente reducido versiones de los métodos estándar de análisis a escala de laboratorio, la exactitud y la precisión se negocian para la velocidad y el rendimiento. Sobre todo, este resultado se debe a errores mayores en pequeña pipeta de volumen y un peso; así como una mayor samplia heterogeneidad como tamaño de la muestra disminuye. Mientras que los grandes conjuntos de muestras pueden ser examinados y comparados, el gran cuidado debe ejercerse cuando se hacen comparaciones entre campañas separadas y con los resultados a escala de laboratorio.

Las mayoría de los pasos que consumen tiempo implican la manipulación física de la biomasa. Muestras de molienda puede tardar varios minutos por muestra, incluyendo la limpieza de la fábrica entre las muestras. Carga manual, la descarga, y tolvas de limpieza y llenado y vaciado de bolsas de té y bolsas de muestras también es muy intensivo en mano de obra. Si bien cada paso puede tardar un minuto o más, haciendo miles de muestras pueden tomar muchas horas o incluso días. Los robots pueden cargar un plato típico reactor con la biomasa en aproximadamente de 3 a 4 horas o 6 para placas de 8 días ^{-1 -1} robot. Esta situación depende de los parámetros de precisión utilizados, así como el tipo y la cantidad de biomasa a ser probado. Llenar placas de reactores con agua, ácido diluido, o enzima se hace rápidamente usando un robot de manipulación de líquidos. Pretratamiento de una pila de placas (de 1 a 20 placas de reactores) tarda entre 1 y 3 horas cuando el conjunto, enfríe y desmontaje incluido. Hidrólisis enzimática tarda 3 días y el análisis de azúcar requiere alrededor de 1 hora de tiempo de preparación más 10 minutos por plato reactor para completar el ensayo y leer los resultados. Un programa semanal de establecidos días previos al tratamiento y análisis de capacidad para un horario de trabajo razonable, minimizando extraña horas y los fines de esfuerzos para el componente humano de la prueba y permite el procesamiento ~ 800 a 1000 muestras por semana de manera continua. El rendimiento máximo depende de varios factores, sobre todo de cómo están disponibles para hacer el trabajo manual tanto de hardware (robots, placas de reactores, etc.) y la cantidad de "software" (es decir, la dotación de personal). El límite superior práctico es 2500 a 3000 muestras / semana; sin embargo, que la producción requiere un funcionamiento 7 días a la semana y varios becarios y técnicos de los estudiantes. En comparación, 3.000 muestras por HPLC requerirían aproximadamente 125 días de samanálisis PLE más la mano de obra adicional de pesaje manualmente muestras en los reactores y las muestras de filtrado antes del análisis.

Protocol

1. Alto rendimiento determinación de glucosa y xilosa rendimientos Siguiendo enzimática Sacarificación 9,29 Preparación de la muestra (molienda, De-almidonado, extracción, tratamiento previo) Moler al menos 300 mg de cada muestra de la biomasa utilizando un molino Wiley, de tal manera que las partículas pasan a través de una malla 20 (850 micras) pantalla. Transferencia a zip-top antiestáticas bolsas (normalmente con código de barra) y la información de la muestra registro a la b…

Representative Results

El efecto combinado del pretratamiento termoquímico y posterior enzima de sacarificación se mide como una función de la masa de glucosa y xilosa liberado al final del ensayo. Los resultados se reportan en términos de miligramos de glucosa y xilosa liberados por gramo de biomasa. Esto está en marcado contraste con los datos reportados a partir de ensayos a escala de banco, que generalmente se reporta como por ciento de rendimiento teórico basado en análisis de la composición del material de partida. Como todavía…

Discussion

Los pasos clave de preparación de muestras para la obtención de datos precisa y reproducible cuando se realizan experimentos de selección de alto rendimiento son las siguientes:

Azúcar Ensayo de lanzamiento:

En general, las muestras se preparan en lotes que van desde unas pocas docenas a varios miles a la vez. Cada paso importante se lleva a cabo típicamente para todas las muestras antes de mover hacia adelante con el fin de minimizar las variaciones en la p…

Materials

Wiley mill	Thomas Scientific	3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)
anti-static bags	Minigrip*	MGST4P02503	2.5×3", multiple suppliers available
tin-coated copper wire	McMaster-Carr	8871K84	0.016" diameter, bend-and-stay wire
tea-bags	Herbco	press n' brew teabags	3.5×5 inches
gluco-amylase	Novozymes	Spirizyme Fuel
alpha-amylase	Novozymes	Liquozyme SC DS
sodium acetate trihydrate	any chemical supplier		reagent grade
acetic acid	any chemical supplier		reagent grade
190 proof (95%) ethanol	any chemical supplier		reagent grade
hoppers	Freeslate
96-well C-276 Hastelloy plates	Aspen Machining (Lafayette, Colorado)	N/A (custom built)
1/8” soldering iron tip	Sears
silicone-adhesive backed Teflon tape	3M	5180	3" wide (36-yard rolls)
enzyme solution	Novozymes		Cellic CTec2
citric acid monohydrate	any chemical supplier
trisodium citrate dihydrate	any chemical supplier
disposable, polystyrene 96-well plates	Greiner Bio-One	655101	or equivalent; multiple suppliers available
glucose oxidase/peroxidase	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose dehydrogenase	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
glucose standard solution	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose standard solution	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
stainless steel sample cups	Frontier Laboratories	PY1-EC80F
glass fiber sheets	Pall	66227	8×10" sheets–circles punched with standard hole punch
Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock	NIST	8491
Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock	NIST	8492
Monterey Pine Whole Biomass Feedstock	NIST	8493
Wheat Straw Whole Biomass Feedstock	NIST	8494