Hochdurchsatz-Screening von Widerspenstigkeit Variationen in Lignocellulose-reicher Biomasse: Gesamt Lignin, Lignin-Monomeren und enzymatische Zuckerfreisetzung

Summary

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Abstract

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Introduction

Da die weltweite Versorgung mit nicht-erneuerbaren Energieträger und die dazugehörigen Produkte sinkt, haben Wissenschaftler herausgefordert, ähnlichen Kraftstoffen und Chemikalien aus pflanzlichen Quellen ¹ zu erstellen. Ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit ist zu bestimmen, welche Arten von Pflanzen können für die Produktion von Biokraftstoffen und Biomaterialien ^2,3 sein. Üblicherweise werden diese Einsatzstoffe für Lignin, Cellulose und Hemicellulose bewertet; sowie ihre Anfälligkeit für deconstruction (recalcitrance), durch thermische, mechanische und / oder chemische Vorbehandlung mit oder ohne anschließender Enzym Verzuckerung. Detailliertere Analysen werden verwendet, um die spezifische Zusammensetzung der Lignin und Hemicellulose-Fraktionen sowie eine optimale Enzymaktivitäten benötigt bestimmen. Transgene Modifikationen von Pflanzen, die nicht eigen Sie besitzen ideale Merkmale für biochemische oder thermochemische Umwandlung, um die gewünschten Rohstoffe haben die Forscher mit einer stark erweiterten Quelle Topf bereitgestelltzielle Ausgangsmaterialien ^4. Die Standard-Analyseverfahren zum Quantifizieren der chemischen Eigenschaften einer Pflanze, während sehr nützlich für kleine Probenmengen, nicht geeignet sind für das schnelle Screening von Hunderten oder Tausenden von Proben ^5-7. Die hierin beschriebenen HTP Methoden wurden entwickelt, um schnell und effizient auszuwerten zahlreiche Biomasse Varianten für Veränderungen in der Zellwand recalcitrance thermochemische und / oder enzymatischen Abbau.

Es ist wichtig zu verstehen, dass die hier beschriebenen HTP-Screening-Assays wurden nicht entwickelt, um Wandlungs- oder Ertrag zu maximieren. Das Ziel ist der relative Unterschied in der intrinsischen recalcitrance verwandter Biomasseproben zu bestimmen. Als Folge sind viele der Analyseschritte von den "typischen" Umwandlung von Biomasse-Assays, wo das Ziel ist es, maximale Conversion-Rate oder das Ausmaß zu erhalten, abweichen. Beispielsweise werden geringer Vorbehandlung severities und kürzere Enzymhydrolyse verwendet zu maximieren abweichenschiede zwischen den Proben. In den meisten Fällen relativ hohe Enzymbeladungen verwendet werden, um Unterschiede, die durch experimentelle Variation der Enzymaktivität, die die Ergebnisse erheblich verfälschen könnte reduzieren.

Schnelle Techniken zur Bestimmung der Zusammensetzung von Pflanzenzellwänden und den monomeren Zuckern freigesetzte folgenden enzymatischen Verzuckerung gehören Robotik, besonders angefertigt, thermochemisch kompatible 96-Well-Platten, und Modifikationen der Standard-Labormethoden ^8-11 und Instrumental-Protokolle, wie Schwingungsspektroskopie (IR- (IR), im nahen Infrarotbereich (NIR) oder Raman) und magnetische Kernresonanz (NMR) ^12-17. Diese Methoden sind der Schlüssel zur Isolierung von Ausgangsmaterialien mit hoher Cellulose oder niedrigen Ligningehalt, oder diejenigen erwartet, die höchsten Glucose, Xylose, Ethanol Ausbeute usw. Diese Methoden wurden heruntergerechnet Analysen, die kleinere Mengen an Biomasse und Verbrauchsmaterialien verwenden aktiviert, was zu einer Senkung der Versuchs Kosten ¹⁸ </sup>. Ein weiteres Merkmal dieser methodische Ansatz ist, dass verschiedene Versuchsbedingungen schnell zu sein, und in einigen Fällen gleichzeitig ausgewertet. Beispielsweise kann eine Vielzahl von unterschiedlichen Vorbehandlungsstrategien oder Enzymcocktails getestet werden, so dass die optimalen experimentellen Parameter schnell identifiziert und verwendet werden. Beliebte Einsatzmaterialien, wie beispielsweise Maisstroh ^9, Pappel ^8,10, Bagasse ^{8 und} Switch ⁸ wurden erfolgreich unter Verwendung dieser HTP Verfahren bewertet.

Gesamt Lignin und Lignin Monomerzusammensetzung werden auch üblicherweise quantifiziert Biomasse Züge. Verringerungen der Ligningehalt haben gezeigt, dass die enzymatische Verdaubarkeit von Polysacchariden ^19,20 erhöhen. Die Rolle, die das Lignin monomeren Verhältnis (oft als Syringyl / Guaiacyl (S / G) gemeldet) spielt in der Dekonstruktion der Pflanzenzellwand wird noch untersucht. Einige Berichte haben gezeigt, dass eine Verringerung des S / GQuote führte zu einer erhöhten Glucoseausbeuten nach der Hydrolyse ^21, während andere Studien enthüllen den gegenläufigen Trend ^19,22. Hochdurchsatz-Methoden zur Bewertung Lignin und seine Monomere sind Schwingungsspektroskopie (IR, NIR und ^{Raman-23-26),} die mit der multivariaten Analyse und Pyrolyse Molekularstrahl-Massenspektrometrie (pyMBMS) ^27,28.

Bei der Entwicklung von HTP Verfahren zum Screenen von Biomasse müssen mehrere integrale Überlegungen im Auge gehalten werden. Ein wichtiger Aspekt ist die Komplexität des Verfahrens. Was ist die erforderliche Qualifikationsniveau für die Technik? Chemometrische Analysen zum Beispiel erfordern bestimmte Fähigkeiten für den Aufbau, Bewertung und Aufrechterhaltung der Vorhersagemodelle. Die Standardmethoden weisen unerwünschte Vor- oder Datenanalyseschritte oder beschäftigen toxischen Reagenzien. Entwicklung der Modelle ist ein laufender Prozess, wo neue Daten über die Zeit, um die Robustheit des Modells zu erhöhen in das Modell ein. Ein weiterer ConsIDmenarbeit ist die Kosteneinsparungen und verringerte experimentellen Analysezeiten der vorgeschlagenen Hochdurchsatzverfahren. Wenn die Methode ist sehr schnell, aber sehr teuer ist, kann es keine praktikable Methode für viele Labors, um anzunehmen. Die in dieser Handschrift dargestellten Verfahren sind Varianten von standardisierten Techniken modifiziert, um die Durchsatzfähigkeiten zu verstärken. Diese Protokolle quantitativ die Biomasse Merkmale von Interesse zu messen, ohne die Notwendigkeit der Entwicklung von Vorhersagemodellen. Dies ist ein Schlüsselattribut dieser Techniken, da Vorhersagemethoden, während sie eine starke Korrelationen mit den Standardanalysen verwendet, um die Modelle zu entwickeln, sind nicht so genau wie eigentlich Messung der Menge von Interesse für die Proben. Während die Verwendung von im wesentlichen nach unten Versionen von Standard-Labormaßstab Analysemethoden skaliert Verfahren werden Genauigkeit und Präzision für die Geschwindigkeit und Durchsatz gehandelt. Meist ist dieses Ergebnis aufgrund höherer Fehlern in kleinen Volumen Pipettieren und Wiegen; sowie erhöhte sreichliche Heterogenität als Stichprobengröße wird verringert. Während große Sample-Sets können gesiebt und verglichen werden, müssen große Sorgfalt, wenn Vergleiche zwischen den einzelnen Kampagnen und den Labormaßstab Ergebnisse ausgeübt werden.

Die zeitaufwendigsten Schritte erfordern die physikalische Manipulation der Biomasse. Schleifen Proben kann mehrere Minuten pro Probe, einschließlich Reinigung der Mühle zwischen den Proben zu nehmen. Manuelles Laden, Entladen und Reinigungstrichter und Befüllen und Entleeren Teebeutel und Probenbeutel ist auch sehr arbeitsintensiv. Während jeder Schritt kann eine Minute oder länger dauern kann dabei Tausende von Proben viele Stunden oder sogar Tage dauern. Die Roboter können eine typische Reaktorplatte mit Biomasse in etwa 3 bis 4 Stunden oder 6 bis 8 Platten ^Tag -1 Roboter laden ^-1. Diese Situation hängt von der Genauigkeit Parameter sowie der Art und der Menge an Biomasse zu prüfenden verwendet. Füllen Reaktorplatten mit Wasser, verdünnter Säure oder Enzym wird schnell mit einem Liquid-Handling-Roboters durchgeführt. PNachbehandlung von einem Plattenstapel (1 bis 20 Reaktorplatten) dauert zwischen 1 und 3 Stunden, wenn Montage, abkühlen und Demontage enthalten. Enzymhydrolyse dauert 3 Tage und die Zuckeranalyse benötigt etwa 1 Stunde Vorbereitungszeit plus 10 min pro Reaktorplatte, um den Test abzuschließen und lesen Sie die Ergebnisse. Ein Wochenplan gesetzt Vorbehandlung und Analyse Tage nimmt eine vernünftige Arbeitszeiten, ungerade Stunden und am Wochenende Anstrengungen für die menschliche Komponente des Assays zu minimieren und ermöglicht die Verarbeitung ~ 800 bis 1000 Proben pro Woche auf kontinuierlicher Basis. Der maximale Durchsatz von mehreren Faktoren abhängig, vor allem, wie viel Hardware (Roboter, Reaktoren Platten, etc.) und wie viel "Software" (dh Personal) stehen zur Verfügung, um die manuelle Arbeit zu tun. Die praktische obere Grenze ist 2500 bis 3000 Proben / Woche; erfordert jedoch, dass Ausgangs 7 Tage in der Woche Betrieb und mehrere Praktikanten und Techniker. Im Vergleich dazu würden 3.000 Proben mittels HPLC etwa 125 Tagen sam erforderlichB. Analyse plus die zusätzliche Arbeit der Hand mit einem Gewicht von Proben in Reaktoren und Filterproben vor der Analyse.

Protocol

1. Hochdurchsatz-Bestimmung von Glucose und Xylose Renditen nach enzymatischer Verzuckerung 9,29 Probenvorbereitung (Schleifen, De-starching, Gewinnung, Vorbehandlung) Schleifen mindestens 300 mg jeder Biomasse Probe unter Verwendung einer Wiley-Mühle, so daß die Teilchen durch ein 20 mesh passieren (850 um) Bildschirm. Transfer zum antistatischen zip-Top-Taschen (typischerweise Strichcode) und Plattenprobeninformationen zum Barcode-Datenbank. In etwa 250 mg oder mehr des Grund…

Representative Results

Der kombinierte Effekt der thermochemischen Vorbehandlung und anschließende Enzym Verzuckerung wird als Funktion der Masse der Glucose und Xylose am Ende des Tests gemessen und errechnet. Die Ergebnisse sind in der Einheit Milligramm von Glucose und Xylose pro Gramm Biomasse frei gemeldet. Dies steht in krassem Gegensatz zu den Daten aus Labormaßstab Assays, die üblicherweise als prozentuale theoretische Ausbeute, bezogen auf die Zusammensetzungs-Analyse des Ausgangsmaterials gemeldet wird, gemeldet. Da es noch nicht…

Discussion

Die wichtigsten Schritte der Probenvorbereitung für den Erhalt von genauen und reproduzierbaren Daten bei der Durchführung von Hochdurchsatz-Screening-Versuche sind wie folgt:

Zucker Release Assay:

Im Allgemeinen werden die Proben in Lose von wenigen Dutzend bis zu mehreren Tausend zu einem Zeitpunkt hergestellt. Jedem Hauptschritt wird typischerweise für alle Proben vor, um Schwankungen in der Zubereitung zwischen Proben zu minimieren Vorwärtsbewegung durchg…

Materials

Wiley mill	Thomas Scientific	3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)
anti-static bags	Minigrip*	MGST4P02503	2.5×3", multiple suppliers available
tin-coated copper wire	McMaster-Carr	8871K84	0.016" diameter, bend-and-stay wire
tea-bags	Herbco	press n' brew teabags	3.5×5 inches
gluco-amylase	Novozymes	Spirizyme Fuel
alpha-amylase	Novozymes	Liquozyme SC DS
sodium acetate trihydrate	any chemical supplier		reagent grade
acetic acid	any chemical supplier		reagent grade
190 proof (95%) ethanol	any chemical supplier		reagent grade
hoppers	Freeslate
96-well C-276 Hastelloy plates	Aspen Machining (Lafayette, Colorado)	N/A (custom built)
1/8” soldering iron tip	Sears
silicone-adhesive backed Teflon tape	3M	5180	3" wide (36-yard rolls)
enzyme solution	Novozymes		Cellic CTec2
citric acid monohydrate	any chemical supplier
trisodium citrate dihydrate	any chemical supplier
disposable, polystyrene 96-well plates	Greiner Bio-One	655101	or equivalent; multiple suppliers available
glucose oxidase/peroxidase	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose dehydrogenase	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
glucose standard solution	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose standard solution	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
stainless steel sample cups	Frontier Laboratories	PY1-EC80F
glass fiber sheets	Pall	66227	8×10" sheets–circles punched with standard hole punch
Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock	NIST	8491
Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock	NIST	8492
Monterey Pine Whole Biomass Feedstock	NIST	8493
Wheat Straw Whole Biomass Feedstock	NIST	8494