총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열
Summary
Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.
Abstract
The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.
Introduction
비 재생 연료 및 관련 제품 하락의 글로벌 공급으로, 과학자들은 식물 유래 소스 1에서 유사 연료 및 화학 물질을 만드는 데 도전하고있다. 이 작업의 핵심은 식물의 종은 바이오 연료 및 바이오 소재 2,3의 생산에 적합 할 수있는 결정하는 것입니다. 일반적으로 이러한 원료는 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 콘텐츠에 대한 평가; 뿐만 아니라 또는 이후의 효소 당화하지 않고, 열 기계, 및 / 또는 화학적 전처리를 통해 해체 (반항)에 감수성있다. 자세한 분석이 필요 헤미셀룰로오스, 리그닌 및 분획물의 특정 조성물뿐만 아니라 최적의 효소 활성을 결정하기 위해 사용된다. 본질적으로 원하는 상품에 생화학 적 또는 열 화학적 변환을위한 이상적인 특성을 소유하지 않는 식물의 형질 변경은 냄비의 크게 확장 된 소스와 연구자를 제공하고 있습니다ential 원료 4. 작은 샘플 세트에 매우 유용하지만, 화학 플랜트의 특징을 정량화하는 표준 분석 방법은 시료 5-7 수백 또는 수천의 신속한 스크리닝 부적당하다. 본원에 기재된 방법 HTP 신속하고 효율적으로 열 화학적 및 / 또는 효소 분해에 세포벽 들음의 변화를 바이오 매스 변이체 다수을 평가하기 위해 개발되어왔다.
그것은 HTP 스크리닝 분석법은 본원에 기술 된 변환이나 수율을 최대화하도록 설계되지 않았다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 목적은 관련 미생물 시료 극한 들음에 상대적인 차이를 결정하는 것이다. 결과적으로, 분석 단계의 많은 목적은 최대 전환율 또는 범위를 획득하는 것 "전형적인"바이오 매스 변환 분석, 다르다. 예를 들어, 저급 전처리 심각도 짧은 효소 가수 분해 시간은 다를 최대화하기 위해 이용된다샘플 사이에 화상 으. 대부분의 경우, 상대적으로 높은 효소 로딩 상당히 결과를 왜곡 할 수있는 효소 활성 실험 변형으로 인한 차이를 감소시키기 위해 사용된다.
식물 세포 벽과 단량체 설탕의 구성을 결정하기위한 신속한 기술은 효소 당화 적외선 등의 진동 분광학과 같은 로봇, 사용자 정의, 열화학 호환 96 웰 플레이트 및 표준 실험 방법 8-11의 수정 및 악기 프로토콜을 (포함 다음의 해방 (IR), 근적외선 (NIR), 또는 라만) 및 핵 자기 공명 (NMR) 12-17. 이 방법은 실험의 감소로 이어지는 높은 셀룰로오스 또는 낮은 리그닌 내용, 또는 가장 높은 포도당, 자일 로스, 에탄올을 산출하기 위해 예상되는 등 이러한 방법은 바이오 매스 및 소모품의 소량을 사용 축소 된 분석을 활성화와 원료를 분리하는 열쇠입니다 비용 (18) </s>까지. 방법론이 접근법의 또 다른 특징은 다양한 실험 조건이 빠르게 될 수 있도록하며, 동시에 어떤 경우에는 평가. 예를 들어, 전처리 전략 또는 효소 칵테일 다른 다양한 최적 실험 파라미터 빨리 식별되고 사용될 수 있도록, 테스트 될 수있다. 옥수수 여물 9, 포플러 8, 10, 사탕 수수 사탕 수수 (8), 및 스위치 그래스 (8)과 같은 인기있는 원료는 성공적으로 HTP 방법을 사용하여 평가되었다.
총 리그닌과 리그닌 단량체 조성물은 또한 일반적으로 바이오 매스의 특성을 정량화하고 있습니다. 리그닌 함량의 감소는 다당류 (19, 20)의 효소 소화율을 증가시키는 것으로 나타났다. 리그닌 단량체 비율 (자주 syringyl / guaiacyl (S / G) 내용보고)이라는 역할은 아직 조사 중입니다 식물 세포 벽의 해체에서 재생됩니다. 일부 보고서는 지적했다 그 S / G의 감소다른 연구는 반대의 경향 19, 22을 공개하면서 비는 가수 분해 (21) 다음의 증가 포도당 수익률되었다. 리그닌과 단량체를 평가 처리량이 방법은 진동 다변량 분석 결합 분광법 (IR, NIR 및 라만 23-26), 및 열분해 분자 빔 질량 분석법 (pyMBMS) 27, 28을 포함한다.
매스 HTP 스크리닝 방법을 개발하는 경우, 여러 일체 고려 유념 할 필요가있다. 하나의 중요한 양상은 방법의 복잡성이다. 기술에 필요한 기술 수준은 무엇인가? 계량 화학 분석, 예를 들어, 구성, 평가 및 예측 모델을 유지하기위한 특별한 기술을 필요로한다. 표준 방법은 바람직하지 않은 준비 또는 데이터 분석 단계를 전시 또는 독성 시약을 사용한다. 모델의 개발은 새로운 데이터 모델의 견고성을 높이기 위해 시간 동안 모델에 통합 진행 과정이다. 또 다른 consideration은 비용을 절감하고 제안 된 고 처리량 방법의 실험적 분석 시간을 감소시켰다. 상기 방법은 상당히 빠르게하지만, 매우 고가 인 경우가 많은 실험실 채택위한 가능한 방법이 될 수 없다. 이 원고에 도시 된 방법은 스루풋 성능들을 증폭하도록 수정 표준화 기술의 변형이다. 이러한 프로토콜은 정량적 예측 모델의 개발을 필요없이 관심있는 미생물의 특성을 측정한다. 표준 모델을 개발하는 데 사용되는 분석과 강한 상관 관계를 보이는 동안이 예측 방법부터이 기술의 핵심 속성이다, 실제로 샘플에 대한 관심의 양을 측정하는만큼 정확하지 않습니다. 기본적으로 표준 벤치 규모 분석 방법의 버전을 축소되어 사용되는 방법 반면, 정확도와 정밀도는 속도와 처리량을 상장되어 거래되고있다. 대부분,이 결과는 작은 볼륨 피펫 및 무게에 더 높은 오류로 인해; 뿐만 아니라 증가 된 에스샘플 크기와 충분한 이질성이 감소된다. 큰 샘플 세트가 상영과 비교 될 수 있지만 별도의 캠페인 사이의 벤치 규모의 결과 비교를 할 때, 큰주의를 기울여야한다.
대부분의 시간 소모 단계 바이오 매스의 물리적 조작을 포함한다. 연삭 샘플은 샘플 사이의 밀을 청소 포함 샘플 당 몇 분을 취할 수있다. 수동, 하역, 청소 호퍼로드 및 작성, 차 가방 및 샘플 가방을 비우는 것은 매우 노동 집약적이다. 각 단계는 분 이상 걸릴 수 있지만, 샘플의 일을 수천 몇 시간 또는 며칠이 걸릴 수 있습니다. 로봇은 약 3 ~ 4 시간 또는 6 -1 플레이트 하루 8 로봇 바이오 매스와 일반적인 원자로 판을로드 할 수 있습니다 -1. 이러한 상황은 물론 시험 될 형 바이오 매스의 양으로 사용 정밀도 파라미터들에 의존한다. 물과 반응 판을 작성, 산을 희석 또는 효소 신속하게 액체 처리 로봇을 사용하여 수행됩니다. 피접시 스택 (1-20 반응 판)의 재치료는 어셈블리, 냉각시 1 ~ 3 시간 소요되며, 분해가 포함되어 있습니다. 효소 가수 분해 3 일 걸리며 당 분석 결과 분석을 완료하고 읽을 준비 시간 약 1 시간 플러스 반응기 접시 당 10 분을 필요로한다. 설정 전처리 및 분석 일의 주간 스케줄은 지속적으로 주당 800 ~ 1,000 샘플을 분석의 인간의 구성 요소에 대한 이상한 시간과 주말 노력을 최소화, 합리적인 작업 일정을 수용하고 처리 할 수 있습니다. 최대 처리량이 많은 하드웨어 (로봇, 원자로 판 등), 얼마나 많은 "소프트웨어"(즉, 인력)이 수동 작업을 할 수 있습니다 주로하는 방법, 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 실제 상한은 2,500 ~ 3,000 샘플 / 주이다 그러나, 출력은 칠일 – 주 작업과 다수의 학생 인턴 및 기술자를 필요로한다. 비교하여, HPLC에 의해 3,000 샘플 SAM의 약 125일을 필요PLE 분석 플러스 수동으로 분석하기 전에 원자로 및 필터링 샘플로 샘플 무게의 추가 노동.
Protocol
Representative Results
Discussion
다음 높은 처리량 스크리닝 실험을 실시 할 때 정확하고 재현성있는 데이터를 획득하기위한 키 샘플 준비 단계는 다음과 같다
설탕 자료 분석 :
일반적으로, 샘플은 수십에서 한 번에 수천에 이르기까지 많은 준비되어있다. 각 주요 단계는 전형적으로 샘플 제제 사이의 편차를 최소화하기 위해 전진에 앞서 모든 샘플에 대해 수행된다. 디 녹말 원래 프?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.
Materials
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | ||
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5×3", multiple suppliers available | |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire | |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5×5 inches | |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | ||
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | ||
|
any chemical supplier | reagent grade | ||
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | ||
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | ||
| hoppers | Freeslate | |||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | ||
| 1/8” soldering iron tip | Sears | |||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) | |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | ||
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | |||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | |||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available | |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | ||
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8×10" sheets–circles punched with standard hole punch | |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | ||
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | ||
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | ||
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
- Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., Himmel, M. E., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).
