الإنتاجية العالية فحص الاختلافات الإستعصاء في Lignocellulosic الكتلة الحيوية: إجمالي اللجنين، اللجنين مونمرات، والأنزيمية السكر الإصدار
Summary
Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.
Abstract
The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.
Introduction
كما المعروض العالمي من الوقود غير المتجددة والتي تراجع المنتجات المرتبطة بها، وقد تحدى العلماء لخلق الوقود مماثلة والمواد الكيميائية من مصادر المشتقة من النباتات 1. أحد الجوانب الرئيسية لهذا العمل هي تحديد أي نوع من النباتات قد تكون مناسبة لإنتاج الوقود الحيوي والمواد الحيوية 2،3. عادة، يتم تقييم هذه المواد الأولية لاللجنين، السليلوز، والمحتوى هيميسيلولوز. فضلا عن قابليتها للالتفكيكية (عناد) من خلال المعالجة الحرارية والميكانيكية، و / أو كيميائية مع أو بدون لاحقة انزيم التسكير. تستخدم تحليلات أكثر تفصيلا لتحديد التشكيل المحدد لاللجنين وهيميسيلولوز الكسور وكذلك الأنشطة الإنزيمية المثلى اللازمة. وقد وفرت التعديلات المعدلة وراثيا من النباتات التي لا تملك في جوهرها الصفات المثالية لتحويل الكيمياء الحيوية أو حراري للسلع المطلوبة للباحثين مصدر توسعت بشكل كبير من وعاءالمواد الأولية ential 4. الطرق التحليلية القياسية لقياس الصفات الكيميائية للنبات، وإن كان مفيدا جدا لمجموعات عينة صغيرة، وغير مناسبة للفحص السريع لمئات أو آلاف من عينات 5-7. وقد تم تطوير أساليب بالمشاركه الموصوفة هنا بسرعة وكفاءة لتقييم أعداد كبيرة من المتغيرات الكتلة الحيوية للتغيرات في جدار الخلية عناد إلى تدهور حراري و / أو الأنزيمية.
فمن الأهمية بمكان أن نفهم أن فحوصات الكشف بالمشاركه ووصفت الوثيقة لم يتم تصميمها لتحقيق أقصى قدر من التحويل أو العائد. والهدف من ذلك هو تحديد الاختلافات النسبية في عناد لا يتجزأ من عينات الكتلة الحيوية ذات الصلة. ونتيجة لذلك، فإن العديد من الخطوات التحليل تختلف عن "نموذجية" المقايسات تحويل الكتلة الحيوية، حيث كان الهدف هو الحصول على الحد الأقصى لمعدل التحويل أو حد. على سبيل المثال، يتم استخدام أقل الشدة المعالجة وأقصر الأوقات إنزيم التحلل المائي لتعظيم تختلفبسبب الخلافات بين العينات. في معظم الحالات، يتم استخدام شحنات انزيم عالية نسبيا للحد من الخلافات نظرا لاختلاف التجريبي في نشاط انزيم، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج بشكل ملحوظ.
تقنيات سريعة لتحديد تكوين خلايا النبات الجدران والسكريات أحادى المحررة يلي التسكير الأنزيمية تشمل الروبوتات، حسب الطلب، متوافقة thermochemically لوحات 96-جيدا، وإدخال تعديلات على أساليب المختبر القياسية 8-11 والبروتوكولات مفيدة، مثل التحليل الطيفي الذبذبات (الأشعة تحت الحمراء (IR)، القريب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)، أو رامان) والرنين المغناطيسي النووي (NMR) 12-17. هذه المنهجيات هي المفتاح لعزل المواد الأولية مع السليلوز عالية أو محتويات اللجنين منخفضة، أو تلك المتوقع أن يحقق أعلى الجلوكوز، الفركتوز، والإيثانول، الخ وقد مكنت هذه الأساليب التحليلات يضيق نطاق التي تستخدم كميات أقل من الكتلة الحيوية والمواد الاستهلاكية، مما يؤدي إلى تخفيضات في التجريبية حساب 18 </sتصل>. ميزة أخرى لهذا النهج المنهجي هي أن ظروف تجريبية مختلفة يمكن أن يكون سريعا، وفي بعض الحالات في وقت واحد، تقييمها. على سبيل المثال، مجموعة متنوعة من مختلف استراتيجيات المعالجة أو الكوكتيلات الانزيم يمكن اختبار، والسماح للمعلمات التجريبية المثلى لتحديدها بسرعة وموظفات. المواد الأولية شعبية، مثل حطب الذرة 9، الحور 8،10، تفل قصب السكر 8، والتبن 8 تم تقييم بنجاح باستخدام هذه الأساليب بالمشاركه.
مجموع اللجنين وتكوين أحادى اللجنين كما كميا عادة الصفات الكتلة الحيوية. وقد ثبت تخفيضات في محتوى اللجنين لزيادة هضم الأنزيمية من السكريات 19،20. الدور الذي لنسبة أحادى اللجنين (في كثير من الأحيان كما ذكرت syringyl / guaiacyl (S / G) المحتوى) يلعب في تفكيك جدار الخلية النباتية لا يزال قيد التحقيق. وقد أشارت بعض التقارير أن التخفيضات في S / Gأدت نسبة لزيادة الغلة الجلوكوز بعد التحلل 21، في حين أن دراسات أخرى كشف الاتجاه المعاكس 19،22. أساليب إنتاجية عالية لتقييم اللجنين وأحادية لها تشمل التحليل الطيفي الذبذبات (IR نير، ورامان 23-26) إلى جانب التحليل متعدد المتغيرات، والانحلال الحراري شعاع الجزيئي الطيفي (pyMBMS) 27،28.
عند وضع أساليب بالمشاركه لفحص الكتلة الحيوية، وتحتاج عدة اعتبارات أساسية ينبغي أن يوضع في الاعتبار. واحد الجوانب الرئيسية هو تعقيد الأسلوب. ما هو مستوى المهارة المطلوب للتقنية؟ تحليلات Chemometric، على سبيل المثال، تتطلب مهارات محددة للبناء، وتقييم، والحفاظ على النماذج التنبؤية. الطرق المعيارية يحمل غير مرغوب فيها خطوات تحليل تحضيرية أو البيانات أو توظف الكواشف السامة. تطوير نماذج عملية مستمرة حيث يتم إدخال بيانات جديدة في النموذج مع مرور الوقت لزيادة متانة النموذج. consid أخرىeration هو وفورات في التكاليف وانخفاض الأوقات تحليل التجريبية من الأساليب الإنتاجية العالية المقترحة. إذا كان الأسلوب هو سريع جدا، ولكن مكلفة جدا، قد لا تكون تقنية مجدية للعديد من المختبرات لاعتماده. الأساليب هو موضح في هذه المخطوطة هي أنواع من تقنيات موحدة أو تعديل لتضخيم القدرات الإنتاجية. هذه البروتوكولات قياس كميا الصفات الكتلة الحيوية التي تهم دون يستلزم تطوير نماذج تنبؤية. هذا هو السمة الرئيسية لهذه التقنيات، منذ أساليب التنبؤ، في حين أنه يظهر الارتباطات القوية مع معيار التحليلات المستخدمة في تطوير النماذج، ليست دقيقة مثل قياس فعلا كمية من الفائدة للعينات. في حين أن الطرق المستخدمة يتم تحجيم أساسا بانخفاض إصدارات الأساليب التحليلية مقاعد البدلاء النطاق القياسية، يتم تداول الدقة والإحكام للسرعة والإنتاجية. في الغالب، هي نتيجة لأخطاء العليا في pipetting لحجم صغير ووزن هذه النتيجة؛ فضلا عن زيادة الصورةوانخفض التجانس وافرة مثل حجم العينة. بينما مجموعات عينة كبيرة يمكن فحص ومقارنة، يجب توخي الحذر الشديد عند إجراء مقارنات بين حملات منفصلة ونتائج مقاعد البدلاء النطاق.
وتشمل معظم الخطوات تستغرق وقتا طويلا التلاعب المادي من الكتلة الحيوية. عينات طحن قد يستغرق عدة دقائق لكل عينة، بما في ذلك تنظيف مطحنة بين العينات. تحميل يدويا والتفريغ، والنطاط تنظيف وتعبئة وتفريغ أكياس الشاي وأكياس عينة هي أيضا عمل مكثفة جدا. في حين أن كل خطوة قد يستغرق دقيقة واحدة أو أكثر، والآلاف فعل عينات قد يستغرق عدة ساعات أو حتى أيام. يمكن الروبوتات تحميل لوحة مفاعل نموذجية مع الكتلة الحيوية في حوالي 3-4 ساعة أو 6-8 لوحات اليوم -1 الروبوت -1. هذا الوضع يعتمد على معايير الدقة المستخدمة وكذلك نوع وكمية الكتلة الحيوية لفحصها. ملء وحات مفاعل بالماء، وتمييع حامض، أو يتم الإنزيم بسرعة باستخدام الروبوت معالجة السائل. Pإعادة معالجة من كومة وحة (1-20 وحات مفاعل) ما يستغرق ما بين 1 و 3 ساعة عندما التجمع، ويبرد، وتضمنت التفكيك. التحلل انزيم تستغرق 3 أيام ويتطلب تحليل السكر حوالي 1 ساعة من الوقت الإعدادية بالإضافة إلى 10 دقيقة لكل لوحة مفاعل لاستكمال فحص وقراءة النتائج. جدول الأسبوعي لمجموعة المعالجة والتحليل أيام يستوعب جدول أعمال معقول، والتقليل من الفردية ساعة وعطلة نهاية الأسبوع الجهود لعنصر البشري في الفحص ويسمح للتجهيز ~ 800 إلى 1000 عينة في الأسبوع على أساس مستمر. الحد الأقصى للسرعة تعتمد على عدة عوامل، أهمها كيف هم الكثير من الأجهزة (الروبوتات، المفاعلات لوحات، الخ)، وكيف الكثير من "البرمجيات" (أي الموظفين) المتاحة للقيام بهذا العمل اليدوي. الحد الأعلى العملي هو 2500 إلى 3000 عينات / أسبوع؛ مع ذلك، أن الناتج يتطلب عملية 7 أيام في الأسبوع والطلاب المتدربين متعددة والفنيين. وبالمقارنة، فإن 3000 العينات بواسطة HPLC تتطلب ما يقرب من 125 يوما من سامتحليل التنوير القائل بالإضافة إلى العمل الإضافي وزنها يدويا العينات في المفاعلات وعينات الترشيح قبل التحليل.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات تحضير العينة الرئيسية للحصول على بيانات دقيقة وقابلة للتكرار عند إجراء الإنتاجية العالية التجارب العرض كالتالي:
السكر الإصدار الفحص:
بشكل عام، يتم إعداد العينات في الكثير تتراوح بين ب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.
Materials
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | ||
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5×3", multiple suppliers available | |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire | |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5×5 inches | |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | ||
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | ||
|
any chemical supplier | reagent grade | ||
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | ||
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | ||
| hoppers | Freeslate | |||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | ||
| 1/8” soldering iron tip | Sears | |||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) | |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | ||
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | |||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | |||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available | |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | ||
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8×10" sheets–circles punched with standard hole punch | |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | ||
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | ||
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | ||
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
- Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., Himmel, M. E., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).
