Высокая пропускная способность Скрининг непокорности Вариации в лигноцеллюлозной биомассы: Total лигнина, лигнин мономеров и ферментативной сахара версии
Summary
Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.
Abstract
The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.
Introduction
Как мировой поставку невозобновляемых видов топлива и связанных с ними продуктов снижается, ученые были оспорены, чтобы создать аналогичные виды топлива и химических веществ из растительного происхождения источников 1. Ключевым аспектом этой работы является определение, какие виды растений могут быть пригодны для производства биотоплива и биоматериалов 2,3. Как правило, эти исходные материалы оценивают по лигнина, целлюлозы, гемицеллюлозы и содержания; а также их восприимчивости к деконструкции (непокорности) через тепловой, механической и / или химической обработки с или без последующей фермента осахаривания. Более детальный анализ используется для определения конкретного состава лигнина и гемицеллюлозы фракций, а также оптимальные активность ферментов, необходимых. Трансгенные модификации растений, которые не обладают внутренне идеальные черты для биохимического или термохимической конверсии к желаемым товаров обеспечили исследователям значительно расширил источника горшокциальных сырье 4. Стандартные аналитические методы для количественного химические черты завода, в то время как весьма полезным для небольших наборов образцов, не подходят для быстрого скрининга сотен или тысяч образцов 5-7. Методы, описанные здесь, ПВТ были разработаны быстро и эффективно оценить большое количество вариантов биомассы изменений в клеточной стенки непокорности в термохимической и / или ферментативного расщепления.
Очень важно понимать, что ПВТ методы скрининга, описанные выше, не был разработан, чтобы максимально преобразование или выход. Целью является определить относительные различия в сопротивляемости разрушению образцов связанных биомассы. В результате, многие из шагов анализа отличаются от "типичных" конверсии биомассы анализов, где целью является получить максимальную скорость преобразования или степень. Например, более низкие уровни важности предварительной обработки и более короткие времена ферментативного гидролиза используют, чтобы максимизировать отличаютсятывает между образцами. В большинстве случаев, относительно высокие нагрузки ферментов используются для уменьшения различий из-за различий в экспериментальной активности фермента, которые могли бы существенно исказить результаты.
Быстрые методы для определения состава клеточных стенок растений и мономерных сахаров освобождаю- следующие ферментные осахаривания включают робототехнику, индивидуальные, термохимически совместимые 96-луночные планшеты и модификации стандартных лабораторных методов и инструментальных 8-11 протоколы, такие как колебательной спектроскопии (ИК (ИК), ближнем инфракрасном (БИК), или комбинационное) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) 12-17. Эти методики являются ключом к изоляции сырья с высоким целлюлозы или низким содержанием лигнина, или те, ожидается выход высокий глюкозы, ксилозы, этанол и т.д. Эти методы позволили с уменьшенным анализы, которые используют меньшее количество биомассы и расходных материалов, что приводит к снижению экспериментальная Расходы 18 </sдо>. Еще одной особенностью этого подхода является то, методической, что различные экспериментальные условия могут быть быстро и одновременно в некоторых случаях, оценили. Например, множество различных стратегий для предварительной обработки или фермента коктейли могут быть проверены, что позволяет наиболее оптимальные параметры эксперимента, которые будут быстро определить и работу. Популярная сырье, такие как кукурузные стебли 9, тополь 8,10, сахарный тростник жома 8 и просо 8 были успешно оценены с помощью этих методов HTP.
Всего лигнин и лигнин мономерный состав также обычно количественно черты биомассы. Снижение содержания лигнина было показано для повышения ферментативной усвояемость полисахаридов 19,20. Роль, которую лигнин мономерный отношение (часто сообщается в сирингиловых / guaiacyl (S / G) содержание) играет в деконструкции завод клеточной стенки находится в стадии расследования. В некоторых докладах указывается, что сокращение S / GОтношение привело к увеличению урожайности глюкозы следующих гидролиза 21, в то время как другие исследования представит противоположную тенденцию 19,22. Высокие методы оценки пропускной лигнина и его мономеров включают колебательной спектроскопии (ИК, БИК, и комбинационного 23-26) в сочетании с многомерного анализа и пиролиза молекулярно-пучковой масс-спектрометрии (pyMBMS) 27,28.
При разработке методов ПВТ для скрининга биомассы, несколько интегральных соображения должны иметь в виду,. Одним из ключевых аспектов является сложность способа. Что необходимый уровень знаний для техники? Хемометрические анализы, например, требуют специальных навыков для построения, оценки и поддержания прогнозных моделей. Стандартные методы демонстрируют нежелательные действия подготовительного или анализа данных, или использовать токсичные реагенты. Разработка моделей представляет собой непрерывный процесс, где новые данные включены модели с течением времени, чтобы увеличить устойчивость модели. Еще considчества является экономия средств и снижение экспериментальные раз анализ предложенных методов с высокой пропускной. Если метод достаточно быстрый, но очень дорого, она не может быть целесообразным методом для многих лабораторий принять. Методы, представленные в этой рукописи варианты стандартных методов, модифицированных для усиления возможности производительности. Эти протоколы количественного измерения биомассы черты интерес, без необходимости разработки прогнозных моделей. Это является ключевым атрибутом этих методов, так как методы прогнозирования, в то время как выставляется сильные корреляции со стандартной анализ используется для разработки модели, не так точны, как на самом деле измерения количества интерес для образцов. В то время как методы, используемые в основном сократили версии стандартных ходе лабораторных аналитических методов, точность и точность торгуются на скорость и пропускную способность. Главным образом, этот результат за счет более высоких ошибок в малом объеме пипетки и взвешивания; а также увеличение сдостаточно неоднородность как размер выборки уменьшается. В то время как большие наборы образцов могут быть подвергнуты скринингу и по сравнению, большое внимание должно быть осуществлено при сравнении между отдельными кампаниями и в ходе лабораторных результатов.
Самые трудоемкие шаги включают физические манипуляции биомассы. Шлифовальные образцы может занять несколько минут за образец, в том числе очистки из мельницы между пробами. Вручную погрузка, разгрузка, и моющие Дозаторы и наполнения и опорожнения чайные пакетики и примеры сумки тоже очень трудоемкий. Хотя каждый шаг может занять минуту или больше, делая тысячи образцов может занять несколько часов или даже дней. Роботы могут загрузить типичный реактор тарелку с биомассой в 3 до 4 часов или от 6 до 8 пластин день -1 -1 робота. Эта ситуация зависит от параметров, используемых точности, а также от типа и количества биомассы для тестирования. Заполнение реактора пластины водой, разбавленной кислотой, или фермент быстро сделано с использованием жидкого обслуживание робота. РРегенерация стека пластины (от 1 до 20 реакторов пластин) занимает от 1 до 3 ч, когда монтаж, охладить и демонтаж входит в стоимость. Фермент гидролиза занимает 3 дня и анализ сахара требует около 1 часа времени подготовительной плюс 10 мин на пластины реактора для завершения анализа и чтения результатов. Еженедельный график, установленных предварительной обработки и анализа дней вмещает разумный график работы, сводя к минимуму нечетным час и в выходные дни усилия для человеческого компонента анализа и позволяет для обработки ~ 800 до 1000 проб в неделю на постоянной основе. Максимальная пропускная зависит от нескольких факторов, в основном, сколько аппаратных средств (роботы, реакторы плиты и т.д.) и сколько "обеспечение" (т.е., штатное расписание) доступны, чтобы сделать ручной работы. Практическое верхний предел от 2500 до 3000 выборок / неделю; однако, что выход требует 7 дней в неделю операции и несколько студентов-стажеров и технических специалистов. Для сравнения, 3000 образцов по ВЭЖХ потребует примерно 125 дней СэмаPLE анализ плюс дополнительная рабочая вручную весом образцы в реакторах и образцов фильтрующих до анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ключевые шаги пробоподготовки для получения точной и воспроизводимых данных при проведении высокой пропускной скрининг экспериментов таковы:
Сахар-релиз анализа:
В общем, Образцы готовят в большом диапазоне от нескольких десятков до нескольких тысяч о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.
Materials
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | ||
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5×3", multiple suppliers available | |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire | |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5×5 inches | |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | ||
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | ||
|
any chemical supplier | reagent grade | ||
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | ||
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | ||
| hoppers | Freeslate | |||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | ||
| 1/8” soldering iron tip | Sears | |||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) | |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | ||
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | |||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | |||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available | |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | ||
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8×10" sheets–circles punched with standard hole punch | |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | ||
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | ||
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | ||
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
- Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., Himmel, M. E., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).
