הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה"כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר
Summary
Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.
Abstract
The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.
Introduction
כאספקה הגלובלית של דלקים שאינם מתחדשים וירידות המוצרים הקשורים בם, מדענים כבר קראו תיגר ליצור דלקים וכימיקלים דומים ממקורות 1 מופק מצמח. היבט מרכזי של עבודה זו הוא קביעה שמינים של צמחים עשויים להיות מתאימים לייצור של דלק ביולוגי וביו-חומרים 2,3. בדרך כלל, בחומרי גלם אלה מוערכים ליגנין, תאית, ותוכן hemicellulose; כמו גם הרגישות שלהם לפירוק (סרבנות) באמצעות טיפול מקדים תרמי, מכאני, ו / או כימי עם או בלי saccharification אנזים שלאחר מכן. ניתוח מפורט יותר נמצא בשימוש כדי לקבוע את ההרכב הספציפי של השברים ליגנין והמיצלולוז, כמו גם פעילויות אנזים אופטימליות הדרושות. שינויים מהונדסים של צמחים שאינם מהותית יש תכונות אידיאלי להמרה ביוכימי או תרמה-לסחורות הרצויות סיפקו חוקרים עם מקור התרחב מאוד של סירחומר הזינה ential 4. שיטות האנליטיות סטנדרטי לכימות התכונות הכימיות של צמח, ואילו שימושי למדי עבור קבוצות מדגם קטנות, אינן מתאימות לסינון המהיר של מאות או אלפי דגימות 5-7. שיטות HTP המתוארות במסמך זה כבר התפתח במהירות וביעילות כדי להעריך מספרים גדולים של גרסאות יומסה לשינויים בתא קיר סרבנות השפלה תרמה-ו / או אנזימטי.
זה קריטי כדי להבין שמבחני מיון HTP מתוארים במסמך זה לא תוכנן על מנת למקסם את ההמרה או תשואה. המטרה היא לקבוע הבדלים יחסי בסרבנות הפנימית של דגימות ביומסה בנושא. כתוצאה מכך, רבים מהצעדים הניתוח שונים מהמבחנים "הטיפוסיים" הגיור ביומסה, שבו המטרה היא להשיג יחס המרה מרבי או מידה. לדוגמא, נמוכות חומרות טיפול מקדים ופעמים הידרוליזה אנזים קצרות משמשות למקסם שונהences בין דגימות. ברוב המקרים, עומסי אנזים גבוהים יחסית משמשים להפחתת הבדלים עקב וריאציה ניסיונית בפעילות אנזים, אשר יכולה להטות את התוצאות באופן משמעותי.
טכניקות מהירות לקביעת ההרכב של צמח תא-קירות וסוכרי monomeric המשוחררים הבאות saccharification האנזימטית כוללות רובוטיקה, צלחות מותאמות אישית, thermochemically תואמות 96-היטב, ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטית 8-11 ופרוטוקולי אינסטרומנטלי, כגון ספקטרוסקופיה רטט (אינפרא אדום (IR), קרוב אינפרא אדום (ניר), או ראמאן) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) 12-17. מתודולוגיות אלה הן מפתח לבידוד חומרי גלם גבוה של תאית או תוכן ליגנין נמוך, או לאלה צפויים להניב גלוקוז, קסילוז, אתנול הגבוה ביותר, וכו 'שיטות אלה אפשרו ניתוחי downscaled שמעסיקים כמויות קטנות יותר של ביומסה ומתכלים, שהובילו לירידה בניסוי חשבון 18 </sעד>. תכונה נוספת של גישה המתודולוגית זה היא שתנאי ניסוי שונים יכולים להיות במהירות, ובמקרים מסוימים בו-זמנית, העריכה. לדוגמא, במגוון של אסטרטגיות שונות לפני הטיפול או קוקטיילים אנזים ניתן לבדוק, המאפשר פרמטרים הניסיוניים האופטימלי ביותר להיות מזוהים במהירות ובמועסקת. חומרי גלם פופולריים, כגון התירס Stover 9, 8,10 צפצפה, פסולת קני סוכר 8, וקליפות 8 נבדקו בהצלחה תוך שימוש בשיטות אלה HTP.
ליגנין סה"כ והרכב monomeric ליגנין גם לכמת נפוץ תכונות יומסה. ירידות בתוכן ליגנין הוכחו להגדיל את העיכול אנזימטי של סוכרים 19,20. התפקיד שיחס monomeric ליגנין (לעתים קרובות כפי שדווח syringyl / guaiacyl (S / G) תוכן) משחק בפירוק של דופן תא הצמח הוא עדיין בחקירה. דיווחים חלקם הצביעו על כך שההפחתה בS / Gיחס הוביל לתשואות גלוקוז מוגברות הבאים הידרוליזה 21, ואילו מחקרים אחרים לחשוף את המגמה ההפוכה 19,22. שיטות תפוקה גבוהות להערכה ליגנין ומונומרים שלה כוללות ספקטרוסקופיה רטט (IR, NIR, וראמאן 23-26) בשילוב עם ניתוח רב משתני, וספקטרומטריית פירוליזה קרן מולקולרית מסה (pyMBMS) 27,28.
בעת פיתוח שיטות HTP להקרנה ביומסה, כמה שיקולים נפרד צריכים להיות כל הזמן בראש. אחד היבטים מרכזיים הוא את המורכבות של השיטה. מהי רמת המיומנות הנדרשת לטכניקה? ניתוחי chemometric, למשל, דורשים מיומנויות ספציפיות לבנייה, להערכה ולשמירה על מודלים חזוי. השיטות סטנדרטי להציג צעדי ניתוח הכנה או נתונים לא רצויים או להעסיק ריאגנטים רעילים. פיתוח המודלים הוא תהליך מתמשך שבו נתונים חדשים שולבו המודל לאורך זמן כדי להגדיל את חוסנו של המודל. מצידך עודeration הוא החיסכון בעלויות והירידה פעמים ניתוח ניסיוניות של שיטות תפוקה גבוהה המוצעות. אם השיטה היא די מהירה, אבל יקרה מאוד, זה לא יכול להיות טכניקה אפשרית למעבדות רבות לאמץ. השיטות מתוארות בכתב היד הזה הן גרסאות של טכניקות סטנדרטיות, שונה כדי להגביר את יכולות התפוקה. פרוטוקולים אלה כמותית למדוד את תכונות יומסה של עניין ללא צורך בפיתוח מודלים חזוי. זוהי תכונת מפתח של שיטות אלו, שכן שיטות חיזוי, ואילו בתערוכת מתאמים חזקים עם סטנדרטי ניתוחים המשמשים לפיתוח המודלים, אינם מדויקים כמו בעצם מדידת הכמות של ריבית לדגימות. ואילו שיטות המשמשות בעצם scaled למטה גרסאות של שיטות אנליטיות ספסל בקנה מידה סטנדרטית, דיוק ודיוק נסחרים במהירות ותפוקה. בעיקר, תוצאה זו היא בשל טעויות גבוהות יותר בפיפטה נפח הקטנה ובמשקל; כמו גם הגדיל את יםההטרוגניות בשפע כגודל מדגם היא ירד. בעוד יכולים להיות מוקרנים סטי מדגם גדולים והשוואה, בזהירות רבה צריכה להיות מופעלת בעת ביצוע השוואות בין מסעות פרסום נפרדים ולתוצאות ספסל בקנה מידה.
צעדי הזמן רב ביותר כרוכים המניפולציה הפיסית של ביומסה. דגימות שחיקה עשויות להימשך מספר דקות לדגימה, כולל ניקוי הטחנה בין דגימות. באופן ידני בטעינה, פריקה, ומין ניקוי ומילוי וריקון שקיות תה ושקיות דגימה היא גם מאוד עבודה אינטנסיבית. בעוד כל צעד יכול לקחת דקות או יותר, אלפים עושים דגימות עשויים לקחת שעות רבות ואפילו ימים. הרובוטים יכולים לטעון צלחת כור טיפוסית עם ביומסה בכ 3 עד 4 שעות או 6 עד 8 יום צלחות -1 רובוט -1. מצב זה תלוי בפרמטרים המדויקים המשמשים גם כסוג והכמות של ביומסה להיבדק. מילוי צלחות כור במים, לדלל חומצה, או אנזים נעשה במהירות באמצעות רובוט טיפול נוזלי. Pטיפול חוזר של מחסנית צלחת (1 עד 20 צלחות כור) לוקח בין 1 ל 3 שעות כאשר הרכבה, להתקרר, והפירוק כלול. הידרוליזה אנזים לוקחת 3 ימים וניתוח הסוכר דורש כ 1 שעה של זמן הכנה בתוספת 10 דקות לכל צלחת כור כדי להשלים את assay ולקרוא את התוצאות. לוח זמנים שבועיים של ימים לפני הטיפול וניתוח נקבעו להכיל את לוח הזמנים של עבודה סבירה, מזעור מאמצים מוזר שעות ביממה וסוף השבוע למרכיב האנושי של assay ומאפשר עיבוד ~ 800 ל -1,000 דגימות בשבוע באופן שוטף. התפוקה המקסימלית תלויה במספר גורמים, בעיקר כמה חומרה (רובוטים, צלחות כורים, וכו ') וכמה "תוכנה" (כלומר, כוח אדם) זמינים לעשות את העבודה הידנית. הגבול העליון המעשי הוא 2,500 עד 3,000 דגימות / שבוע; עם זאת, פלט שדורש פעולה 7 ימים בשבוע ומתמחים סטודנט מרובה וטכנאים. לשם השוואה, 3,000 דגימות על ידי HPLC ידרשו כ 125 ימים של סםניתוח ple תוספת עבודה נוספת של משקל ידני דגימות לכורים ודגימות סינון לפני הניתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדי הכנת מדגם המפתח לקבלת נתונים מדויקים ושחזור בעת ביצוע ניסויי הקרנת תפוקה גבוהה הם כדלקמן:
סוכר השחרור Assay:
באופן כללי, דגימות ערוכים הרבה הנע בין כמה עשרות לכמה אלף בכל פעם. כל צעד גדול מת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.
Materials
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | ||
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5×3", multiple suppliers available | |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire | |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5×5 inches | |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | ||
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | ||
|
any chemical supplier | reagent grade | ||
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | ||
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | ||
| hoppers | Freeslate | |||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | ||
| 1/8” soldering iron tip | Sears | |||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) | |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | ||
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | |||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | |||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available | |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | ||
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8×10" sheets–circles punched with standard hole punch | |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | ||
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | ||
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | ||
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
- Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., Himmel, M. E., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).
