Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

Summary

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Abstract

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Introduction

Como a oferta global de combustíveis não renováveis ​​e os seus associados produtos declínios, os cientistas foram desafiados a criar combustíveis e produtos químicos similares a partir de fontes de origem vegetal ^1. Um aspecto importante deste trabalho é determinar que espécies de plantas podem ser adequados para a produção de biocombustíveis e biomateriais ^2,3. Tipicamente, estas matérias-primas são avaliadas para a lenhina, celulose, hemicelulose e conteúdo; bem como a sua susceptibilidade à desconstrução (recalcitrante) através de pré-tratamento térmico, mecânico e / ou químico, com ou sem subsequente sacarificação enzimática. Análises mais detalhadas são utilizados para determinar a composição específica das fracções de lignina e hemicelulose, bem como actividades enzimáticas óptimas necessário. Modificações transgênicas de plantas que não intrinsecamente possuem características ideais para a conversão bioquímica ou termoquímica a commodities desejados forneceram os investigadores com uma fonte de grande expansão de maconhacial matérias-primas ^4. Os métodos analíticos padrão para quantificar as características químicas de uma planta, ao mesmo tempo bastante útil para pequenos conjuntos de amostras, não são adequadas para a pesquisa rápida de centenas ou milhares de amostras ^5-7. Os métodos aqui descritos HTP foram desenvolvidas para avaliar rapidamente e com eficiência um grande número de variantes de biomassa para alterações na parede celular recalcitrante à degradação termoquímico e / ou enzimático.

É fundamental compreender que os testes de rastreio HTP aqui descritos não foram concebidos para maximizar a conversão ou o rendimento. O objetivo é determinar as diferenças relativas na recalcitrância intrínseca de amostras de biomassa. Como resultado, muitas das etapas de análise são diferentes dos "típicos" ensaios de conversão da biomassa, onde o objetivo é obter a taxa de conversão máxima ou extensão. Por exemplo, inferiores gravidades de pré-tratamento e tempos mais curtos de hidrólise enzimática são usadas para maximizar diferemcias entre as amostras. Na maioria dos casos, cargas relativamente elevadas de enzimas são usados ​​para reduzir as diferenças devidas à variação experimental da actividade da enzima, o que poderia distorcer os resultados significativamente.

Técnicas rápidas para determinar a composição de plantas de células-paredes e os açúcares monoméricos libertado seguinte sacarificação enzimática incluem robótica, personalizado, placas de 96 poços termoquimicamente compatíveis, e modificações de métodos laboratoriais padrão ^8-11 e protocolos instrumentais, como a espectroscopia vibracional (infravermelho (IV), no infravermelho próximo (NIR), ou de Raman) e de ressonância magnética nuclear (RMN) ^12-17. Estas metodologias são a chave para o isolamento de matérias-primas com alta de celulose ou de baixo teor de lignina, ou aqueles esperado para produzir a mais elevada de glicose, xilose, etanol, etc. Estes métodos permitiram análises downscaled que empregam menores quantidades de biomassa e produtos de consumo, levando a reduções nos experimental custa ¹⁸ </sup>. Outra característica desta abordagem metodológica é que várias condições experimentais pode ser rapidamente e, em alguns casos, ao mesmo tempo, avaliada. Por exemplo, uma variedade de diferentes estratégias de pré-tratamento ou cocktails enzima pode ser testado, permitindo que os parâmetros experimentais mais ideais para ser rapidamente identificados e empregues. Matérias-primas populares, como palha de milho ^9, álamo ^8,10, bagaço de cana ^8, e switchgrass ⁸ foram avaliadas com sucesso usando esses métodos HTP.

Lignina total e composição monomérica lignina também são comumente quantificada traços de biomassa. As reduções no teor de lenhina foram mostrados para aumentar a digestibilidade enzimática de polissacarídeos ^19,20. O papel que a razão monomérica lignina (muitas vezes relatadas como siringil / guaiacil (S / G)) desempenha na desconstrução da parede celular da planta ainda está sob investigação. Alguns relatórios indicaram que as reduções no S / Grácio levou a rendimentos aumentados de glicose após hidrólise ^21, enquanto outros estudos revelam a tendência oposta ^19,22. Métodos de alto rendimento para avaliar a lignina e seus monômeros incluem espectroscopia vibracional (IR, NIR e Raman ^23-26) juntamente com a análise multivariada, pirólise e espectrometria de massa de feixe molecular (pyMBMS) ^27,28.

Ao desenvolver métodos HTP para o rastreio de biomassa, várias considerações integrais precisam ser mantidos em mente. Um aspecto chave é a complexidade do método. Qual é o nível de habilidade necessária para a técnica? Análises quimiométricas, por exemplo, exigem habilidades específicas para a construção, avaliação e manutenção de modelos preditivos. Os métodos padrão de análise exibem passos preparatórios ou dados indesejáveis ​​ou empregar reagentes tóxicos. Desenvolvimento dos modelos é um processo contínuo em que os novos dados são incorporados no modelo ao longo do tempo para aumentar a robustez do modelo. Outra consideperação é a redução de custos e diminuição do tempo de análise dos métodos experimentais de alto rendimento propostas. Se o método é bastante rápida, mas muito dispendioso, não pode ser uma técnica viável para muitos laboratórios a adoptar. Os métodos ilustrados neste manuscrito são variantes técnicas padronizadas, modificados para amplificar as capacidades de rendimento. Estes protocolos medir quantitativamente os traços de biomassa de interesse sem que seja necessário o desenvolvimento de modelos preditivos. Este é um atributo-chave destas técnicas, uma vez que os métodos preditivos, enquanto exibem fortes correlações com o padrão análises utilizados para desenvolver os modelos, não são tão precisos como realmente medir a quantidade de interesse para as amostras. Considerando que os métodos utilizados são essencialmente reduzida versões de métodos analíticos em escala de bancada padrão, exatidão e precisão são negociadas para a velocidade e taxa de transferência. Na maior parte, este resultado é devido a erros maiores na pequena pipetagem volume e pesagem; bem como o aumento sampla heterogeneidade como tamanho da amostra é reduzida. Enquanto as grandes conjuntos de amostras podem ser rastreados e comparados, muito cuidado deve ser exercitado ao fazer comparações entre campanhas separadas e aos resultados em escala de bancada.

Os passos mais demoradas envolvem a manipulação física da biomassa. Amostras de moagem pode levar vários minutos por amostra, incluindo a limpeza do moinho entre as amostras. Carregando manualmente, a descarga, e moegas de limpeza e enchimento e esvaziamento sacos de chá e sacos de amostras também é muito trabalhoso. Embora cada etapa pode demorar um minuto ou mais, fazendo milhares de amostras pode demorar várias horas ou mesmo dias. Os robots podem carregar um reactor típico placa com biomassa em cerca de 3 a 4 horas ou 6 a 8 placas dia ^{-1 -1} robô. Esta situação depende dos parâmetros de precisão utilizados, bem como do tipo e quantidade de biomassa a ser testado. Placas de enchimento do reactor com água, ácido diluído, ou enzima é feito rapidamente, utilizando um manuseamento robô líquido. Pretratamento de uma pilha de placas (de 1 a 20 placas de reactores) leva entre 1 e 3 horas, quando a montagem, esfriar e desmontagem está incluído. Hidrólise enzima leva 3 dias e a análise de açúcar requer cerca de 1 hora de tempo de preparação, mais 10 min por placa reactor para completar o ensaio e ler os resultados. A programação semanal de Set de pré-tratamento e de análise dias acomoda um horário de trabalho razoável, minimizando estranho horas e fins de semana os esforços para o componente humano do ensaio e permite o processamento de ~ 800 a 1.000 amostras por semana em uma base contínua. A taxa de transferência máxima depende de vários fatores, principalmente quanto hardware (robôs, reatores placas, etc.) e quanto "software" (ou seja, recursos humanos) estão disponíveis para fazer o trabalho manual. O limite prático superior é 2.500 a 3.000 amostras / semana; no entanto, que a produção exige operação de sete dias por semana e vários estagiários e técnicos dos estudantes. Em comparação, 3.000 amostras por HPLC exigiria cerca de 125 dias de samanálise ple mais o trabalho adicional de pesagem manualmente amostras em reatores e amostras de filtragem antes da análise.

Protocol

1. alta taxa de transferência de Determinação de Glicose rendimentos e xilose Seguindo enzimática Sacarificação 9,29 Preparação de Amostras (Grinding, De-starching, extracção, pré-tratamento) Moer, pelo menos, 300 mg de cada amostra de biomassa usando um moinho de facas, de modo a que as partículas passam através de uma malha 20 (850 um) de tela. Transferir para sacos zip-top anti-estáticos (normalmente com código de barra) e informações de exemplo registro no banco de dad…

Representative Results

O efeito combinado do pré-tratamento termoquímico e subsequente sacarificação enzimática é medida como uma função da massa de glicose e xilose libertada no final do ensaio. Os resultados são relatados em termos de miligramas de glicose e xilose libertada por grama de biomassa. Isto está em contraste gritante com dados reportados a partir de ensaios em escala de bancada, que normalmente é avaliado como por cento de rendimento teórico com base em análise da composição do material de partida. Como ele ainda …

Discussion

As principais etapas de preparação de amostras para a obtenção de dados precisos e reprodutíveis quando conduzindo experimentos de rastreio de alto rendimento são as seguintes:

Ensaio de Libertação de açúcar:

Em geral, as amostras são preparadas em lotes que vão desde algumas dezenas a milhares de cada vez. Cada passo importante é tipicamente levada a cabo em todas as amostras antes de se mudar para a frente, a fim de minimizar as variações na prep…

Materials

Wiley mill	Thomas Scientific	3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)
anti-static bags	Minigrip*	MGST4P02503	2.5×3", multiple suppliers available
tin-coated copper wire	McMaster-Carr	8871K84	0.016" diameter, bend-and-stay wire
tea-bags	Herbco	press n' brew teabags	3.5×5 inches
gluco-amylase	Novozymes	Spirizyme Fuel
alpha-amylase	Novozymes	Liquozyme SC DS
sodium acetate trihydrate	any chemical supplier		reagent grade
acetic acid	any chemical supplier		reagent grade
190 proof (95%) ethanol	any chemical supplier		reagent grade
hoppers	Freeslate
96-well C-276 Hastelloy plates	Aspen Machining (Lafayette, Colorado)	N/A (custom built)
1/8” soldering iron tip	Sears
silicone-adhesive backed Teflon tape	3M	5180	3" wide (36-yard rolls)
enzyme solution	Novozymes		Cellic CTec2
citric acid monohydrate	any chemical supplier
trisodium citrate dihydrate	any chemical supplier
disposable, polystyrene 96-well plates	Greiner Bio-One	655101	or equivalent; multiple suppliers available
glucose oxidase/peroxidase	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose dehydrogenase	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
glucose standard solution	Megazyme	K-Gluc	Megazyme D-glucose assay kit
xylose standard solution	Megazyme	K-Xylose	Megazyme D-xylose assay kit
stainless steel sample cups	Frontier Laboratories	PY1-EC80F
glass fiber sheets	Pall	66227	8×10" sheets–circles punched with standard hole punch
Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock	NIST	8491
Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock	NIST	8492
Monterey Pine Whole Biomass Feedstock	NIST	8493
Wheat Straw Whole Biomass Feedstock	NIST	8494