Скрининг продуктов питания для 1 класса Интегроны и Джин кассет
Summary
This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.
Abstract
Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.
Introduction
Открытие антибиотиков был одним из величайших научных достижений 20-го века. Тем не менее, использование и злоупотребление антибиотиками привело к быстрой эволюции, устойчивых к антибиотикам бактерий, и они в настоящее время представляют собой серьезную угрозу для общественного здоровья в 21-м веке. Рост бактериальных штаммов, устойчивых к большинству вариантов лечения повышает возможность мы вступаем в эпоху, когда противомикробные препараты уже не эффективны 1,2.
Генетический механизм, который придает устойчивость к антибиотику является древняя система, предшествовавшие людей и антибиотиков давление отбора миллионы лет 3. Мобильные генетические элементы, такие как плазмиды, транспозонов, геномных островов, интегративных конъюгативных элементов и интегронов может распространять гены устойчивости к антибиотикам (ARG) как внутри, так и между видами бактерий 4. Из них интегронами сыграли центральную роль в распространении ARG, несмотря наТо, что они полагаются на плазмид и транспозонов для мобилизации и введении в бактериальных геномов 5. Интегроны захватить генные кассеты, используя интегрон-интегразу, а затем выразить кассеты, используя интегрон закодированный промоутер 6,7 (рисунок 1). Интегрон гена кассеты небольшие подвижные элементы, состоящие из отдельных открытых рамок считывания (ORF), чьи продукты могут придают устойчивость к антибиотикам или дезинфицирующих средств 8. Класс 1 интегронами являются интегронами наиболее часто оправился от клинических изолятов 5, где они все вместе, приобретенных более 130 различных генов кассет устойчивость к антибиотикам 9.
Распространение класса 1 интегронов в синантропных и патогенных бактерий человека связанный генерирует потоки отходов человека, которые содержат большое количество этих генетических элементов 10. По оценкам 10 19 бактерий, которые содержат класс 1 Интегроны освобождены с помощью сточных вод каждый годп Великобритания 11. Поэтому не удивительно, что класс 1 интегронами придающие антибиотиков сопротивления в настоящее время обнаружены в микробиоты диких птиц, рыб и других 12-14 родной природы. Освобождение Интегроны обратно в окружающую среду представляет собой серьезную угрозу для общественного здоровья, так как приобретение новых кассет генов и сложных перестроек с другими мобильными элементами продолжает возникать, в частности, в очистных сооружениях и других водных 15-18. Природная среда становится плодородной вербовки новых детерминант резистентности и условно-патогенных микроорганизмов 19,20. Новые интегрон содержащих бактерии и новые АРГУМЕНТЫ можете круг обратно в человеческом сообществе через зараженную воду и пищу 21,22. Наблюдение окружающей среды аргументов является ключевой стратегией для понимания и управления устойчивостью к антибиотикам в будущем 23. В частности, внимание должно быть уделено пищевых продуктов, которые едят сырыми илислегка приготовленные, так как они представляют собой наибольшую угрозу для передачи новых мобильных элементов и патогенных микроорганизмов.
В этом протоколе, в упрощенном подходе для обнаружения, идентификации и характеризации класса 1 Интегроны и связанные с ними генетические кассеты в пищевых продуктах, изложены (рисунок 2). Использование комбинации культивирование и полимеразной цепной реакции (ПЦР), интегронами можно быстро обнаружить в сложных бактериальных сообществ и отдельных штаммов. Методы определения видов бактерий и конформации и идентичности интегрон связанный генных кассет даны. Этот метод пригоден для широкого круга растений и животных продуктов, и примеры типичных рабочих процессов приведены для каждого из этих типов пищевых продуктов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выявление интегронов и связанных с ними генов кассет потенциально важным шагом в прогнозировании возникновения новых патогенных возбудителей, отслеживание пути для патогенов в пищевой цепи человека, а также выявление новых сопротивление и вирулентности детерминанты 8,21,26. Цель…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодаря Микаэла зале, Лариса Bispo и Густаво Таварес для технической помощи.
Materials
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Used in all PCRs |
| RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) | Sigma | R6513-10MG | Used in all PCRs |
| HinFI restriction enzyme | Promega | R6201 | Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA |
| 100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Used as a size standard on all agarose gels |
| GelRed DNA stain | Biotium | 41003 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| Guanidinium Thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| CLS-TC Solution | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction |
| Lysing Matrix E FastPrep tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available. |
| binding matrix | MP Biomedicals | 116540408 | Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method. |
| Fast Prep machine | MP Biomedicals | Number of options available | MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information |
References
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
- Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
- Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
- Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
- Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
- Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
- Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
- Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
- Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
- Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
- Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
- Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
- Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
- Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
- Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
- Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
- Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
- Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
- Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
- Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what’s new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
- Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
- Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
- Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
- Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
- Lane, D. J. . Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).
- Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).
