Screening prodotti alimentari per la Classe 1 integroni e Gene cassette
Summary
This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.
Abstract
Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.
Introduction
La scoperta degli antibiotici è stata una delle più grandi conquiste scientifiche del 20 ° secolo. Tuttavia, l'uso e l'abuso di antibiotici ha portato alla rapida evoluzione dei batteri resistenti agli antibiotici, e questi ora rappresentare una seria minaccia per la salute pubblica nel 21 ° secolo. L'aumento di ceppi batterici resistenti alla maggior parte delle opzioni di trattamento solleva la possibilità che stiamo entrando in un'era in cui i farmaci antimicrobici non sono più efficaci 1,2.
Il macchinario genetico che conferisce resistenza agli antibiotici è un antico sistema, anticipando gli esseri umani e le pressioni di selezione antibiotici da milioni di anni 3. Elementi genetici mobili, come i plasmidi, trasposoni, isole genomiche, elementi di coniugazione integrativi e integroni possono diffondere geni resistenti agli antibiotici (ARG), sia all'interno e tra specie batteriche 4. Di questi, integroni hanno svolto un ruolo centrale nella diffusione di ARG, nonostante lafatto che si basano su plasmidi e trasposoni per la mobilitazione e l'inserimento in genomi batterici 5. Integroni catturano cassette geniche che utilizzano un integrone-integrasi, e quindi esprimono cassette utilizzando un integrone codificato promotore 6,7 (Figura 1). Integron gene cassette sono piccoli elementi mobili costituiti da singole fasi di lettura aperti (ORF) i cui prodotti possono conferire resistenza agli antibiotici e disinfettanti 8. Classe 1 integroni sono i integroni più comunemente recuperati da isolati clinici 5, dove hanno complessivamente acquisito oltre 130 diverse cassette antibiotico gene di resistenza 9.
La diffusione di classe 1 integroni in commensali e batteri patogeni umani associata genera flussi di rifiuti umani che contengono un gran numero di questi elementi genetici 10. Si stima che 10 19 batteri che contengono classe 1 integroni vengono rilasciati tramite fanghi di depurazione ogni anno in il Regno Unito 11. Non è quindi sorprendente che classe 1 integroni che conferiscono resistenza agli antibiotici sono ora rilevati nel microbiota degli uccelli selvatici, pesci e altri fauna selvatica 12-14. Rilasciando integroni indietro nell'ambiente costituisce una significativa minaccia per la salute pubblica, dal momento che l'acquisizione di nuove cassette geniche e riarrangiamenti complessi con altri elementi mobili continua a verificarsi, soprattutto negli impianti di trattamento delle acque reflue e di altri corpi idrici 15-18. L'ambiente naturale diventa un terreno di reclutamento fertile per i nuovi determinanti di resistenza e patogeni opportunisti 19,20. Batteri integrone contenente Nuovi e nuovi ARG possono fare il giro nella comunità umana attraverso acqua e cibo contaminati 21,22. Sorveglianza di ARG ambientali è una strategia chiave per la comprensione e la gestione di resistenza agli antibiotici in futuro 23. In particolare, occorre prestare attenzione agli alimenti che vengono consumati crudi opoco cotti, dal momento che questi rappresentano la più grande minaccia per la trasmissione di nuovi elementi mobili e gli agenti patogeni.
In questo protocollo, un approccio semplificato per il rilevamento, l'identificazione e la caratterizzazione di classe 1 integroni e le loro cassette geniche associate nei prodotti alimentari sono delineati (Figura 2). Utilizzando una combinazione di reazione coltura e della polimerasi a catena (PCR), integroni possono essere rapidamente individuati nelle comunità batteriche complesse e singoli isolati. I metodi per identificare le specie di batteri e la conformazione e l'identità delle cassette geniche Integron associata sono dati. Il metodo è adatto per una vasta gamma di alimenti vegetali e animali, ed esempi di workflow tipici sono fornite per ciascuno di questi tipi di alimenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'identificazione di integroni e le loro cassette geniche associate è potenzialmente un passo fondamentale nel predire l'emergere di nuovi patogeni opportunisti, tracking percorsi per gli agenti patogeni nella catena alimentare umana, e identificando nuova resistenza e la virulenza determinanti 8,21,26. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di descrivere un approccio semplificato per lo screening dei campioni per la classe 1 integroni, che caratterizzano le loro matrici cassette e identificare le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grazie a Michaela Hall, Larissa Bispo e Gustavo Tavares per l'assistenza tecnica.
Materials
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Used in all PCRs |
| RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) | Sigma | R6513-10MG | Used in all PCRs |
| HinFI restriction enzyme | Promega | R6201 | Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA |
| 100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Used as a size standard on all agarose gels |
| GelRed DNA stain | Biotium | 41003 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| Guanidinium Thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| CLS-TC Solution | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction |
| Lysing Matrix E FastPrep tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available. |
| binding matrix | MP Biomedicals | 116540408 | Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method. |
| Fast Prep machine | MP Biomedicals | Number of options available | MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information |
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