הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג'ין קלטות
Summary
This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.
Abstract
Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.
Introduction
גילוי האנטיביוטיקה היה אחד ההישגים המדעיים הגדולים ביותר של המאה ה -20. עם זאת, השימוש וניצול לרעה של אנטיביוטיקה הוביל להתפתחות המהירה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה, ואלה עכשיו מהווים איום רציני לבריאות ציבור במאה ה -21. העלייה של זני חיידקים עמידים למרבית אפשרויות הטיפול מעלה את האפשרות שאנו נכנסים לעידן שבו תרופות נגד חיידקים כבר לא יעילות 1,2.
המכונות הגנטיות שמקנות עמידות לאנטיביוטיקה היא מערכת עתיקה, מקדימים בני אדם ולחצי בחירה אנטיביוטיים על ידי מיליוני שנות 3. אלמנטים גנטיים ניידים, כגון פלסמידים, transposons, איים הגנומי, אלמנטי conjugative אינטגרטיבית וintegrons יכולים להפיץ את הגנים אנטיביוטיקה התנגדות (ARG) הן בתוך ובין מיני חיידקים 4. מבין אלה, integrons שיחק תפקיד מרכזי בהתפשטות ARG, למרותעובדה שהם מסתמכים על פלסמידים וtransposons לגיוס והכנסה לתוך הגנום של חיידקי 5. Integrons ללכוד קלטות גן באמצעות integron-אינטגראז, ולאחר מכן להביע קלטות באמצעות integron מקודד אמרגן 6,7 (איור 1). Integron גן קלטות אלמנטים ניידים קטנים בהיקף של מסגרות יחידה פתוחה קריאה (ORF) שמוצרים יכולים להעניק עמידות לאנטיביוטיקה או חומרי חיטוי 8. integrons Class 1 הוא integrons התאושש הנפוץ ביותר מבידודים קליניים 5, שבו הם רכשו ביחד יותר מ -130 קלטות גן עמידות לאנטיביוטיקה שונות 9.
התפשטות integrons 1 הכיתה לחיידקים פתוגניים commensal וקשורים אנושיים מייצרת זרמי פסולת אנושיים המכילים מספר גדול של אלמנטים הגנטיים אלה 10. 10 19 חיידקים מוערכים המכילים כיתת 1 integrons משתחררים דרך ביוב בוצה כל i שנהn בריטניה 11. לכן זה לא מפתיע שintegrons כיתת 1 המקנות התנגדויות אנטיביוטיקה עכשיו שיראו בחיידקים של ציפור בר, דגים, וחיות ברות האחר 12-14 ילידים. שחרור integrons בחזרה לסביבה מהווה איום משמעותי על בריאות הציבור, מאז רכישת קלטות גן חדשות וארגון מחדש מורכב עם אלמנטים ניידים אחרים ממשיכה להתרחש, במיוחד בצמחים לטיפול בשפכים ובגופי מים אחרים 15-18. הסביבה הטבעית ואז הופכת קרקע פורה לגיוס גורמי התנגדות חדשים ופתוגנים אופורטוניסטיים 19,20. חיידקים המכיל integron רומן וargs החדש יכולים מעגל בחזרה לקהילה האנושית דרך מים ומזון מזוהמים 21,22. מעקב של args הסביבתי הוא אסטרטגיה מפתח להבנה ולניהול עמידות לאנטיביוטיקה בעתיד 23. בפרט, יש לשים לב למזון שאכלו גלם אוקל מבושל, שכן אלה להציג את האיום הגדול ביותר להעברה של אלמנטים ניידים חדשים ופתוגנים.
בפרוטוקול זה, גישה יעילה לאיתור, זיהוי ואפיון כיתת 1 integrons וקלטות הגן הקשור במוצרי מזון מתוארים (איור 2). באמצעות שילוב של תגובת שרשרת culturing ופולימראז (PCR), integrons ניתן לאתר במהירות בקהילות חיידקים מורכבות ומבודדות בודדים. שיטות לזיהוי המינים של חיידקים וקונפורמציה והזהות של קלטות הגן-קשור integron מקבלות. השיטה מתאימה למגוון רחב של מזונות צמחיים ובעלי חיים, ודוגמאות של תהליכי עבודה טיפוסיים ניתנות לכל אחד מסוגי המזון.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי של integrons וקלטות הגן הקשור הוא פוטנציאל צעד מפתח בניבוי הופעתה של פתוגנים אופורטוניסטיים חדשים, מעקב מסלולים לפתוגנים לשרשרת מזון האנושי, וזיהוי התנגדות חדשה וארסי גורמים מכתיבים 8,21,26. מטרת מאמר זה הייתה לתאר גישה יעילה לסינון דגימות לintegrons 1 הכיתה, אפיון מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה למיכאלה אולם, לריסה Bispo וגוסטבו Tavares לקבלת סיוע טכני.
Materials
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Used in all PCRs |
| RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) | Sigma | R6513-10MG | Used in all PCRs |
| HinFI restriction enzyme | Promega | R6201 | Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA |
| 100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Used as a size standard on all agarose gels |
| GelRed DNA stain | Biotium | 41003 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| Guanidinium Thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| CLS-TC Solution | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction |
| Lysing Matrix E FastPrep tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available. |
| binding matrix | MP Biomedicals | 116540408 | Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method. |
| Fast Prep machine | MP Biomedicals | Number of options available | MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information |
References
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
- Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
- Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
- Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
- Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
- Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
- Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
- Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
- Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
- Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
- Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
- Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
- Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
- Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
- Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
- Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
- Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
- Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
- Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
- Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what’s new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
- Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
- Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
- Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
- Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
- Lane, D. J. . Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).
- Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).
