Dépistage denrées alimentaires pour les intégrons de classe 1 et Gene Cassettes
Summary
This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.
Abstract
Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.
Introduction
La découverte des antibiotiques a été l'une des plus grandes réalisations scientifiques du 20 ème siècle. Cependant, l'utilisation et l'abus des antibiotiques a conduit à l'évolution rapide des bactéries résistantes aux antibiotiques, et ceux-ci pose maintenant une menace sérieuse pour la santé publique dans le 21 e siècle. La hausse de souches bactériennes résistantes à la plupart des options de traitement soulève la possibilité que nous entrons dans une ère où les médicaments antimicrobiens ne sont plus efficaces 1,2.
Le mécanisme génétique qui confère une résistance aux antibiotiques est un ancien système, précédant les humains et les pressions de sélection antibiotiques par des millions d'années 3. Éléments génétiques mobiles, tels que les plasmides, les transposons, îlots génomiques, les éléments et les intégrons conjugatifs intégratives peuvent diffuser des gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) à l'intérieur et entre les espèces bactériennes 4. Parmi ceux-ci, intégrons ont joué un rôle central dans la propagation de l'ARG, malgré lafait qu'ils reposent sur des plasmides et des transposons pour la mobilisation et l'insertion dans les génomes bactériens 5. Les intégrons capturer cassettes de gènes en utilisant une intégron-intégrase, puis expriment cassettes en utilisant un promoteur intégron codé 6,7 (Figure 1). Integron gène cassettes sont de petits éléments mobiles constitués de simples cadres de lecture ouverts (ORF) dont les produits peuvent conférer une résistance aux antibiotiques ou de désinfectants 8. Intégrons de classe 1 sont les intégrons le plus souvent récupérées à partir d'isolats cliniques 5, où ils ont acquis collectivement plus de 130 différentes cassettes de gènes de résistance aux antibiotiques 9.
La propagation de la classe 1 intégrons dans commensales et bactéries pathogènes humains associés génère des flux de déchets humains qui contiennent un grand nombre de ces éléments génétiques 10. On estime à 10 19 bactéries qui contiennent intégrons de classe 1 sont libérés par les boues chaque année in le Royaume-Uni 11. Il est donc pas surprenant que les intégrons de classe 1 conférant des résistances aux antibiotiques sont maintenant détectés dans le microbiote des oiseaux sauvages, de poissons et d'autres animaux sauvages indigènes de 12-14. Libérer intégrons dans l'environnement constitue une menace importante pour la santé publique, depuis l'acquisition de nouvelles cassettes de gènes et des réarrangements complexes avec d'autres éléments mobiles continue à se produire, en particulier dans les stations d'épuration et d'autres plans d'eau 15-18. L'environnement naturel devient alors un terrain fertile pour le recrutement de nouveaux déterminants de la résistance et des pathogènes opportunistes 19,20. Bactéries contenant de intégron-nouveaux et de nouvelles ARG peuvent encercler retour dans la communauté humaine à travers l'eau et les aliments contaminés 21,22. Surveillance de l'environnement ARG est une stratégie clé pour la compréhension et la gestion de la résistance aux antibiotiques dans l'avenir 23. En particulier, l'attention devrait être accordée aux denrées alimentaires qui sont consommés crus oulégèrement cuits, puisque ceux-ci présentent la plus grande menace pour la transmission de nouveaux éléments mobiles et des agents pathogènes.
Dans ce protocole, une approche simplifiée pour détecter, identifier et caractériser les intégrons de classe 1 et leurs cassettes de gènes associés dans les denrées alimentaires sont décrits (Figure 2). En utilisant une combinaison de la réaction et de la culture en chaîne par polymérase (PCR), intégrons peuvent être détectés rapidement dans les communautés bactériennes complexes et les isolats individuels. Des procédés pour l'identification des espèces de bactéries et de la conformation et de l'identité des cassettes de gènes associés à intégron sont donnés. La méthode est adaptée pour une large gamme d'aliments végétaux et animaux, et des exemples de workflows typiques sont donnés pour chacun de ces types d'aliments.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'identification des intégrons et leurs cassettes de gènes associés est potentiellement une étape clé dans la prédiction de l'émergence de nouveaux pathogènes opportunistes, suivi des voies pour les agents pathogènes dans la chaîne alimentaire humaine, et l'identification de nouvelles résistances et de la virulence déterminants 8,21,26. Le but de cet article était de décrire une approche rationalisée pour le dépistage des échantillons pour intégrons de classe 1, caractérisant le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci à Michaela Hall, Larissa Bispo et Gustavo Tavares pour l'assistance technique.
Materials
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Used in all PCRs |
| RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) | Sigma | R6513-10MG | Used in all PCRs |
| HinFI restriction enzyme | Promega | R6201 | Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA |
| 100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Used as a size standard on all agarose gels |
| GelRed DNA stain | Biotium | 41003 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| Guanidinium Thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| CLS-TC Solution | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction |
| Lysing Matrix E FastPrep tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available. |
| binding matrix | MP Biomedicals | 116540408 | Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method. |
| Fast Prep machine | MP Biomedicals | Number of options available | MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information |
References
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
- Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
- Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
- Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
- Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
- Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
- Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
- Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
- Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
- Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
- Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
- Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
- Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
- Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
- Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
- Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
- Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
- Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
- Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
- Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what’s new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
- Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
- Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
- Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
- Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
- Lane, D. J. . Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).
- Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).
