Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

Summary

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Abstract

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21^st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

Introduction

A descoberta dos antibióticos foi uma das maiores conquistas científicas do ^século 20. No entanto, o uso e abuso de antibióticos levou à rápida evolução de bactérias resistentes aos antibióticos, e estes agora representam uma séria ameaça para a saúde pública no século ^21. O surgimento de cepas bacterianas resistentes à maioria das opções de tratamento levanta a possibilidade de que estamos entrando em uma era onde as drogas antimicrobianas não são mais eficazes ^1,2.

A maquinaria genética que confere resistência aos antibióticos é um sistema antigo, anterior a seres humanos e pressões de seleção de antibióticos por milhões de anos ^3. Elementos genéticos móveis, tais como plasmídeos, transposões, ilhas genômicas, elementos conjugativos integrativas e integrons podem disseminar genes de resistência a antibióticos (ARG) tanto dentro como entre espécies bacterianas ^4. Destes, integrões têm desempenhado um papel central na propagação de Arg, apesar dafato de que eles dependem de plasmídeos e transposons de mobilização e de inserção no genoma bacteriano ^5. Integrons capturar cassetes de genes que utilizam um íntegron-integrase, e, em seguida, expressar as cassetes utilizando um promotor codificado íntegron ^6,7 (Figura 1). Integron gene cassetes são pequenos elementos móveis consistindo de quadros individuais de leitura abertas (ORF), cujos produtos podem conferir resistência a antibióticos ou desinfectantes ^8. Classe 1 integrons são os integrons mais comumente recuperados a partir de isolados clínicos ^5, onde têm adquiriu coletivamente mais de 130 diferentes cassetes de genes de resistência a antibióticos ^9.

A propagação da classe 1 integrons em comensais e patogênicas de bactérias associadas a humanos gera fluxos de resíduos humanos que contêm um grande número destes elementos genéticos ^10. Estima-se que 10 ¹⁹ bactérias que contêm uma classe integrons são liberados via lodo de esgoto cada ano in o Reino Unido ^11. Portanto, não é surpreendente que uma classe integrons conferem resistências a antibióticos estão agora a ser detectado em microbiota das aves selvagens, peixes e outros animais selvagens nativos ^12-14. Soltar integrons volta para o ambiente constitui uma ameaça grave de saúde pública, desde a aquisição de novos cassetes de genes e rearranjos complexos com outros elementos móveis continua a ocorrer, particularmente em estações de tratamento de esgoto e outros corpos d'água ^15-18. O ambiente natural, em seguida, torna-se um terreno fértil para o recrutamento de novos determinantes de resistência e patógenos oportunistas ^19,20. Bactéria contendo integron novos e novos ARGs pode circular de volta para a comunidade humana através de água e alimentos contaminados ^21,22. Vigilância de ARGs ambientais é uma estratégia fundamental para a compreensão e manejo da resistência aos antibióticos no futuro ^23. Em particular, deve ser dada atenção aos géneros alimentícios que são comidos crus oulevemente cozidos, uma vez que estes apresentam a maior ameaça para a transmissão de novos elementos celulares e patógenos.

Neste protocolo, uma abordagem simplificada para a detecção, identificação e caracterização de classe 1 integrons e suas cassetes de genes associados nos alimentos são descritas (Figura 2). Usando uma combinação de reacção cultura e polimerase em cadeia (PCR), integrões pode ser rapidamente detectada em comunidades bacterianas e complexos isolados individuais. Métodos de identificação das espécies de bactérias e a conformação ea identidade das cassetes de genes associados a integron são dadas. O método é adequado para uma ampla variedade de alimentos de origem vegetal e animal, e exemplos de fluxos típicos são dados para cada um destes tipos de alimentos.

Protocol

Os géneros alimentícios que são comidos crus ou levemente cozidos são de maior preocupação para a saúde humana. Exemplos incluem hortaliças, frutas, mariscos e crustáceos. Coleção 1. Amostra Recolha de amostras sob condições que minimizam a contaminação, e armazenadas em sacos separados, limpas durante o transporte. Uma vez recolhidas, as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C e processados ​​dentro de 24 horas. 2. Enriquecido C…

Representative Results

Triagem de culturas mistas e isolados bacterianos para intI1 O conjunto iniciador HS463a / HS464 PCR pode ser usado para detectar a presença do gene da integrase íntegron-classe 1, intI1 (Figura 1). Este conjunto de iniciadores para a detecção trabalha bem intI1 em culturas mistas, e também é utilizado para rastrear colónias bacterianas colhidas a partir de placas de propagação (Figura 2). Isolados positivos devem gerar uma única ban…

Discussion

A identificação de integrons e suas cassetes de genes associados é potencialmente um passo fundamental para prever o surgimento de novos patógenos oportunistas, acompanhamento de percursos para patógenos na cadeia alimentar humana e identificando nova resistência e virulência determinantes ^8,21,26. O objetivo deste trabalho foi descrever uma abordagem simplificada para a triagem de amostras para a classe 1 integrons, caracterizando suas matrizes cassete e identificar as espécies de bactérias em que r…

Materials

GoTaq Colourless Mastermix	Promega	M7132	Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas)	Sigma	R6513-10MG	Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme	Promega	R6201	Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder	GE Healthcare	27400701	Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain	Biotium	41003	CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium Thiocyanate	Life Technologies	AM9422	CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution	MP Biomedicals	6540409	Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes	MP Biomedicals	116914500	Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
binding matrix	MP Biomedicals	116540408	Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine	MP Biomedicals	Number of options available	MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information